摘要：本文描述了在各種不同的生物樣品中確定細(xì)菌總量及某一特定菌種的量的快速、經(jīng)濟(jì)的cPCR方法。結(jié)果顯示cPCR方法適合進(jìn)行細(xì)菌定量同時(shí)也可以作為可靠的細(xì)菌檢測(cè)方法。內(nèi)標(biāo)法中競(jìng)爭(zhēng)DNA的量可以調(diào)節(jié)避免了假陰性的出現(xiàn)同時(shí)還允許自己設(shè)定陽(yáng)性的閾值。

Abstract:Rapid, cost-effective cPCR methods are described for the determination of the total bacteria count as well as the number of cells of a certain species in a variety of biological samples. cPCR methods are shown to be suitable for quantification and also for the reliable detection of bacteria. The addition of adjustable amounts of competitor DNA for intemal calibration avoids false negatives and permits the setting of a defined threshold over which positive signals are recorded.

        在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)中，用競(jìng)爭(zhēng)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對(duì)細(xì)菌定量有關(guān)生物樣品中細(xì)菌的總量及微生物菌群的組成對(duì)評(píng)估傳染性疾病、診斷感染以及預(yù)見(jiàn)和監(jiān)測(cè)它們的臨床表征十分重要。在其他領(lǐng)域中，包括釀酒業(yè)、化妝業(yè)和廢水處理業(yè)也需要快速經(jīng)濟(jì)的方法來(lái)確定細(xì)菌的量。

　　可用來(lái)檢測(cè)和確定細(xì)菌總量的核酸方法許多方法可以用來(lái)直接或間接地檢測(cè)和確定細(xì)菌的總量。其中包括顯微鏡的方法、細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)、檢測(cè)特征性代謝產(chǎn)物和用特異性抗體測(cè)定表面分子等方法。最近發(fā)展出一些核酸的方法來(lái)檢測(cè)和確定細(xì)菌總量。隨著對(duì)不同細(xì)菌系同源基因DNA序列知識(shí)的不斷積累，這些方法已成為學(xué)術(shù)研究及微生物的日常檢測(cè)中越來(lái)越有用的工具。

　　在所有這些基于DNA的方法中，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)能提供最高度的特異性和敏感性。PCR技術(shù)不僅能夠檢測(cè)出痕量的核酸，而且還能根據(jù)DNA模板生產(chǎn)出和模板一模一樣的制備量的DNA，供進(jìn)一步研究使用。

　　大多數(shù)檢測(cè)細(xì)菌的PCR方法都是針對(duì)165S rRNA基因序列的。雖然這些方法可以很容易地設(shè)計(jì)成具有高度特異性，但是它們卻無(wú)法定量。經(jīng)典的PCR方法只是一個(gè)定性的方法^[1]。因?yàn)樗闹笖?shù)級(jí)放大倍數(shù)以及同樣指數(shù)級(jí)放大的偏差使從大量的PCR產(chǎn)物中確定DNA樣品(模板)的量成為不可能。

　　在過(guò)去的幾年中，人們做了許多嘗試對(duì)PCR進(jìn)行適當(dāng)?shù)目刂埔允蛊淠軌蚨?。在文獻(xiàn)上所描述的各種各樣的定量PCR方法中，有一類依靠外部標(biāo)準(zhǔn)，另一類則依靠?jī)?nèi)部標(biāo)準(zhǔn)^[2，3]。在后一類中，競(jìng)爭(zhēng)性PCR(cPCR)方法是最穩(wěn)定可靠的。它們是基于靶DNA與一個(gè)同源或異源DNA標(biāo)準(zhǔn)共擴(kuò)增，這些基因與樣品模板DNA競(jìng)爭(zhēng)同一套PCR引物^[2]。因?yàn)榧尤氲椒磻?yīng)混合物中的競(jìng)爭(zhēng)物的量是已知的，所以能夠從樣品和競(jìng)爭(zhēng)物DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物之比計(jì)算出靶DNA的量。

　　本文描述了確定細(xì)菌總量的cPCR方法的發(fā)展與應(yīng)用。只要得到群特異定量PCR方法就能很容易地用該方法給不同來(lái)源的生物樣品中的特定菌群定量^[4，5]。

1 實(shí)驗(yàn)

1．1 細(xì)菌特異性定量PCR的開(kāi)發(fā)

　　用Multalin方法[6]對(duì)比了隨機(jī)選擇的近100個(gè)菌群的16S rRNA基因序列，選擇高度保守的序列構(gòu)建細(xì)菌特異性cPCR。設(shè)計(jì)了兩種引物，每一種都與一個(gè)保守的序列區(qū)結(jié)合一個(gè)是正向引物5’-ACTACGTGCCAGCAGCC一3’，一個(gè)是反相引物5’-GACTACCAGGGTATCTAATCC-3’。希望這些引物對(duì)幾乎所有的細(xì)菌群都能產(chǎn)生296?300個(gè)堿基對(duì)的PCR產(chǎn)物^[5]。

　　在cPCRs中，設(shè)計(jì)合成了一個(gè)同源競(jìng)爭(zhēng)物作為DNA標(biāo)準(zhǔn)。為了使從樣品模板和競(jìng)爭(zhēng)物得來(lái)的PCR產(chǎn)物易于分離，設(shè)計(jì)的競(jìng)爭(zhēng)物比模板要短一些。對(duì)細(xì)菌特異的cPCR，競(jìng)爭(zhēng)物是通過(guò)用E．coli基因DNA作為模板。用一個(gè)prbre引物和一個(gè)與模板內(nèi)部的3部分結(jié)合的雜交引物擴(kuò)增獲得的。用于校準(zhǔn)cPCR方法的PCR產(chǎn)物，包括同源競(jìng)爭(zhēng)物，在260 nm處吸收測(cè)量定量。

　　所有的PCR反應(yīng)的總體積均為50pL，在一個(gè)0．2mL的試管中進(jìn)行。模板中每種引物各加40pmol。再加入0．1μmol MgCl₂，2．5nmol各種脫氧核營(yíng)三磷酸，1．25U Thermus aquaticus聚合酶，5μL 10 x Taq緩沖液，加水補(bǔ)充至50pL。PCR擴(kuò)增在GeneAmp 2400DNA thennalcycler上完成。最開(kāi)始的變性溫度為95℃，變性10min，接下來(lái)做40個(gè)循環(huán)，95℃變性，66℃引物退火和延伸，每個(gè)步驟30s。擴(kuò)增產(chǎn)物存于?20℃。用電泳法檢測(cè)擴(kuò)增子(10μL PCR產(chǎn)物在2％瓊脂糖上)電泳時(shí)電壓為10V／cm，緩沖液為T(mén)BE。DNA用溴化乙錠染色然后用E．A．S．Y．視頻凝膠記錄系統(tǒng)進(jìn)行視頻密度計(jì)量定量，用254nm紫外光作透射光。

1．2不同來(lái)源生物樣品的cPCE方法應(yīng)用

　　唾液樣品中細(xì)菌總量的測(cè)定如下對(duì)一個(gè)志愿者，連續(xù)4天內(nèi)停止所有的口腔衛(wèi)生清洗。在第一次取樣前進(jìn)行一次專業(yè)洗牙。然后在早晨8點(diǎn)、中午12點(diǎn)、下午6點(diǎn)飯前分別用10mL無(wú)菌去離子水沖洗口腔來(lái)獲得唾液樣品。在第4天上午8點(diǎn)取樣后再進(jìn)行一次專業(yè)洗牙。樣品進(jìn)行分析前貯存于?20℃。在PCR前，用渦流振蕩和超聲使樣品重新懸浮。cPCR需使用樣品2μL。

1．3人白細(xì)胞濃縮液

　　分析了20份無(wú)菌白細(xì)胞濃縮液。每份樣品都補(bǔ)充已知量的競(jìng)爭(zhēng)物，然后用苯酚抽提／乙醇沉淀，并按上述方法進(jìn)行cPCR。

1．4人白細(xì)胞濃縮液的人工感染

　　在白細(xì)胞濃縮液中加入已知量的不同細(xì)菌進(jìn)行感染，在每1mL新鮮的白細(xì)胞濃縮液中分別加入5xl0⁶的每種菌種。樣品貯于?20℃作為陰性對(duì)照或在37℃下孵育過(guò)夜。樣品的準(zhǔn)備和cPCR測(cè)定過(guò)程均如前所述。

1．5 城市廢水

　　在廢水的cPCR樣品內(nèi)加入已知量的競(jìng)爭(zhēng)物，然后用苯酚抽提，乙醇沉淀，cPCR測(cè)定過(guò)程如上所述。

1．6 參照方法

　　用培養(yǎng)技術(shù)作確定白細(xì)胞濃縮液、廢水和唾液樣品中細(xì)菌總量的參照方法。將直接顯微鏡下的細(xì)胞計(jì)數(shù)用作口腔洗液樣品的參照方法。

2結(jié)果與討論

2．1 細(xì)菌DNA和細(xì)菌總量的cPCB測(cè)定

　　為了證明cPCR方法的實(shí)用性，建立了兩套為細(xì)菌DNA定量的校正曲線。這些曲線是用不同量的PCR產(chǎn)物共擴(kuò)增得到的，這些PCR產(chǎn)物是在引物prbfo和prbre及恒定量的同源競(jìng)爭(zhēng)物存在下擴(kuò)增得到的。因?yàn)?個(gè)E．coU細(xì)胞含有7個(gè)16S rRNA基因拷貝^[7]，所以對(duì)于用定量的PCR為細(xì)菌進(jìn)行量化而言，7個(gè)分子的競(jìng)爭(zhēng)物就相當(dāng)于1個(gè)細(xì)胞。

　　為了證明這個(gè)方法對(duì)細(xì)菌細(xì)胞定量的實(shí)用性，用一系列E．coh細(xì)胞稀釋液與已知量的同源競(jìng)爭(zhēng)物共擴(kuò)增得到校正曲線。圖2a為PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結(jié)果。這些產(chǎn)物是由一系列106?102個(gè)E．coli細(xì)胞稀釋液與恒定量(與104個(gè)E．coli細(xì)胞稀釋液相當(dāng))的同源競(jìng)爭(zhēng)物共擴(kuò)增得到的。圖2b是一個(gè)3倍的視頻密度計(jì)量分析結(jié)果。每一次PCR循環(huán)，根據(jù)所加入的競(jìng)爭(zhēng)物量的不同，該定量方法可適用于測(cè)定101?106個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。該方法的靈敏度受到Taq聚合酶中存在的痕量細(xì)菌DNA的影響。即使非常細(xì)心地準(zhǔn)備，這些痕量細(xì)菌DNA的存在也能導(dǎo)致在空白組中生成PCR產(chǎn)物。在使用溴化乙錠染色的PCR方法中，空白組通常顯示出一條很弱的帶。因此用很低量的同源競(jìng)爭(zhēng)物滴定空白對(duì)照組確定背景細(xì)菌DNA的量十分重要。在每次實(shí)驗(yàn)中都要做這一步。細(xì)菌的擴(kuò)增一般在同源共聚物相當(dāng)于10?100E．coli時(shí)受到抑制。更多量的細(xì)菌DNA的存在表明有污染。此時(shí)整個(gè)實(shí)驗(yàn)必須廢棄。

　　通過(guò)這些實(shí)驗(yàn)可以看出，cPCR適用于DNA定量也適用于細(xì)菌定量。在為細(xì)菌定量中，存在的主要問(wèn)題就是如何選擇一個(gè)合適的條件破壞細(xì)菌。人們發(fā)現(xiàn)在cPCR中7?10min的最初變性時(shí)間及短于1kb的PCR產(chǎn)物能夠直接為所有的被調(diào)查的菌群定量。cPCR結(jié)果與顯微鏡計(jì)數(shù)細(xì)胞相比較表明，在這些條件下，16S rRNA基因的5?6個(gè)拷貝可以用在E．coli和其它細(xì)菌中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2．2不同生物樣品中細(xì)菌總量的確定

　　在口腔停止衛(wèi)生清洗實(shí)驗(yàn)中，唾液中細(xì)菌總量的測(cè)定是通過(guò)口腔沖洗來(lái)實(shí)現(xiàn)的。圖3給出了細(xì)菌總量與時(shí)間的關(guān)系曲線。在口腔停止清洗實(shí)驗(yàn)中，細(xì)菌量逐漸增加并于恢復(fù)清洗后顯著下降。在這個(gè)和其它的相關(guān)研究中，證明cPCR能夠快速有效地監(jiān)測(cè)細(xì)菌量的變化并能快速有效地評(píng)估各種口腔衛(wèi)生措施的有效性。

 

　cPCR還可應(yīng)用于可疑的人白細(xì)胞懸液的細(xì)菌感染的檢測(cè)。對(duì)白細(xì)胞濃縮液或其它血液制品進(jìn)行cPCR分析的一個(gè)問(wèn)題是Taq聚合酶抑制物的存在。PCR抑制物能夠?qū)е聰U(kuò)增產(chǎn)物的丟失。在標(biāo)準(zhǔn)PCR中，這個(gè)結(jié)果與靶DNA缺失所得到的結(jié)果無(wú)法區(qū)分，這將導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果(假陰性)。在cPCR中，樣品模板的缺失會(huì)導(dǎo)致競(jìng)爭(zhēng)物的信號(hào)非常強(qiáng)烈，而PCR抑制劑則既阻止了樣品的擴(kuò)增也阻止了競(jìng)爭(zhēng)物的擴(kuò)增，這樣就很容易將兩者區(qū)分開(kāi)來(lái)。因?yàn)镻CR抑制劑可能存在且需檢測(cè)的白細(xì)胞濃縮液中細(xì)菌DNA的量非常低，因此需要一個(gè)PCR預(yù)處理過(guò)程來(lái)分離和濃縮靶DNA。靶DNA可以得到500倍濃縮。在cPCR分析中，所有被檢測(cè)的白細(xì)胞樣品中都不含細(xì)菌DNA。為了證明該結(jié)果的準(zhǔn)確性，用3種不同的細(xì)菌體外感染人白細(xì)胞濃縮液。用E．coli、Lactobacillus spp及S．mutans感染白細(xì)胞濃縮液的結(jié)果顯示，這3種細(xì)菌在白細(xì)胞濃縮液中的生長(zhǎng)行為不同。通過(guò)用cPCR方法分析新鮮感染的白細(xì)胞濃縮液可以確定相對(duì)于接種細(xì)胞量的細(xì)菌數(shù)。感染樣本在37℃下培養(yǎng)過(guò)夜，與對(duì)照樣本(感染，然后貯存于?20℃中)相比較E．coU細(xì)胞的量增加了3倍，Lactobacillus spp增加了2倍，s．mutans增加了5倍。

　　cPCR方法還應(yīng)用于城市廢水樣品，確定其中的細(xì)菌總量，結(jié)果列于表l。這些結(jié)果顯示cPCR對(duì)這些重度污染樣本有重要的應(yīng)用價(jià)值。用cPCR獲得的結(jié)果與用培養(yǎng)的方法獲得的結(jié)果加以比較可以看出，在大多數(shù)樣品中用cPCR方法測(cè)定的結(jié)果稍微高一些。這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)的方法只能確定活細(xì)菌的量，而cPCR則包括了所有的活細(xì)菌以及剛剛死的但仍含有擴(kuò)增DNA的死細(xì)菌。

 3 結(jié)論

　　快速和經(jīng)濟(jì)的cPCR方法可以成功地用于檢測(cè)各種生物樣品中的細(xì)菌總量以及細(xì)胞數(shù)。cPCR方法適合為細(xì)菌定量，同時(shí)也是一種可靠的細(xì)菌檢測(cè)方法。對(duì)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)法，加入的競(jìng)爭(zhēng)物DNA的量可調(diào)，這不僅避免了樣品中存在的Taq酶抑制劑引起的假陰性而且還可以設(shè)定陽(yáng)性信號(hào)的閾值。

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