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不加三乙胺進行含氮化合物的色譜分離

上一篇 / 下一篇  2008-06-11 12:43:50

引言

  用反相HPLC 分離堿性化合物時,色譜峰的拖尾問題是大多數(shù)色譜工作者非常關(guān)注的問題。堿性和含氮化合物能形成能滿足分離和定量要求的對稱峰。由于許多生物活性化合物都含氮,因此給這些藥物和植化成份的HPLC分析帶來了困擾。

  用反相HPLC分離堿性化合物時,色譜峰的拖尾問題是大多數(shù)色譜工作者非常關(guān)注的問題。堿性和含氮化合物能形成能滿足分離和定量要求的對稱峰。由于許多生物活性化合物都含氮,因此給這些藥物和植化成份的HPLC分析帶來了困擾。

  有幾種克服硅醇基相互作用所致峰拖尾的辦法。常用的措施是降低流動相的pH值,一般pH值小于3 時硅醇基將不再引起峰拖尾。在pH 值小于3 時,硅膠基質(zhì)上的硅醇基被質(zhì)子化(硅醇基的pKa 約為3.5),從而使硅醇基與溶質(zhì)的相互作用減少。但是,這樣也可能改變了分離的選擇性和分離度,因此也不一定是好的選擇。

  第二個措施是提高流動相的離子強度。通過增加流動相的緩沖容量,抑制堿性化合物與硅膠之間的相互作用。但是,當(dāng)增加的緩沖液在儀器內(nèi)外/在進行色譜分析時發(fā)生沉淀,特別是在泵密封墊上發(fā)生沉淀時,可能會帶來其它問題。應(yīng)注意根據(jù)緩沖范圍使用適當(dāng)?shù)木彌_液。表1 列出了幾種最常用的緩沖液。

  另一個可能的解決辦法是在流動相中添加三乙胺(TEA)。TEA作為一種競爭堿,減少了固定相硅醇基的可用性,也減少了分析物與硅醇基之間的相互作用。

 一些色譜工作者不贊成在流動相中加入競爭性胺,因為這使流動相添加了額外成分,將給色譜柱造成不可恢復(fù)的改變。要從色譜柱上洗掉較強的胺,如TEA,非常困難。這一現(xiàn)象的一個例子就是,系統(tǒng)中使用TEA后,正離子模式電噴霧LC/MS一直有m/z 為102的離子,說明污染的不只是柱子,還有管路[1]。要除去TEA,需要用5% 到10% 的醋酸清洗系統(tǒng)。也就是說,被TEA修飾過的柱子不再適用于那些流動相中不含TEA 的應(yīng)用。TEA 的作用是競爭性堿,讓可能反應(yīng)的硅醇基飽和,從而減少峰拖尾的可能性。對大多數(shù)分析來說,10 mM的TEA已經(jīng)足夠,但許多情況下可能使用得更多。而且,TEA的堿性很強,如果添加到?jīng)]有緩沖或弱緩沖能力的流動相中,可能導(dǎo)致溶劑pH值急劇升高,可能會損壞色譜柱,進而影響分離,最終縮短柱壽命。最好的解決辦法是使用對TEA需求最少的色譜柱。

  Eclipse Plus 采用了專利的硅膠處理技術(shù),改進了鍵合和封端工藝,不用添加TEA,靠色譜柱本身就能降低峰拖尾。

實驗部分

  所有分析都在Agilent 1200 上進行,系統(tǒng)包括一個自動進樣器、二極管陣列檢測器、二元泵、脫氣機、柱溫箱。法莫替丁、甲氰脒胍和哌侖西平樣品購自Sigma Aldrich(St. Louis,MO,美國)。將這些樣品溶解在50/50 MeCN 乙腈/水中。白毛茛樣品在當(dāng)?shù)刭徺I,按照參考文獻2 中的步驟,用70/30/0.1% v/v/v 水/乙腈/磷酸提取,超聲、離心,用提取溶劑稀釋。黃藤素、黃連素和白毛莨堿標(biāo)準(zhǔn)購自Sigma Aldrich,用流動相配制。用這些標(biāo)準(zhǔn)品鑒定白毛茛提取物。

結(jié)果與討論

  圖1 是Eclipse Plus C18 柱和另一種C18 柱上分離三種治潰瘍藥物:法莫替丁、甲氰脒胍和哌侖西平(添加TEA和不加TEA)的色譜圖。這三種含氨基藥物的結(jié)構(gòu)見圖2。甲氰脒胍和法莫替丁是組胺H2-受體拮抗劑,通過關(guān)閉產(chǎn)生胃腸液的通路治療治潰瘍。哌侖西平是一種M1-競爭性毒蕈堿受體拮抗劑,能抑制胃酸的產(chǎn)生。治潰瘍藥是最常用的藥物。從圖1 中可以看出,加入10 mM 的TEA后,三種分析物在C18 柱上的峰形得到了改善。加入TEA后哌侖西平峰的拖尾因子從沒加TEA的1.74 變?yōu)?.02。但我們注意到,只要換成Eclipse Plus C18 柱,甲氰脒胍和哌侖西平的峰形和柱效都有了改善。實際上,這些峰的拖尾因子與使用了TEA的C18 非常接近,柱效更高。用Eclipse Plus C18 分析時,不需要任何流動相改性劑就能得到很好的峰形和柱效。

 圖3 顯示了Eclipse Plus C18 柱在分析功能食品白毛茛中的應(yīng)用。白毛茛一直用做抗菌、抗炎、減充血劑,用于治療各種腸道紊亂,是使用最廣泛的功能食品原料之一。采用一種通用的方法[2],評價Eclipse Plus C18和另一種C18柱,加TEA和不加TEA的分離效果。

  在這個例子中,我們測定了500-mg 市售白毛茛根的提取物。白毛茛的兩個主要成分是黃連素和白毛茛堿。方法中提到了黃藤素,但是在測定的植物Hydrastis Canadensis L(北美黃連)中沒有檢測到。這些氨基化合物的結(jié)構(gòu)見圖4。

從色譜圖中可以看出兩點。第一,與另一個C18 柱相比,黃連素在Eclipse Plus C18 上的峰形有所改進。第二,隨著TEA的添加,C18 柱的選擇性有了明顯改善。最后要注意的一點是,在含TEA的色譜圖開始處有許多鬼峰或負(fù)峰。因為添加組分(14 mM TEA)加入到流動相中后,又加酸重新調(diào)節(jié)pH,簡單的流動相變復(fù)雜了,甚至變臟了。包括高質(zhì)量的新鮮試劑的最好的實驗室操作,可以避免這一問題,但流動相污染的可能性仍然存在。更好的選擇是不加TEA。

結(jié)論

  由氨基和硅醇基離子化產(chǎn)生的峰拖尾現(xiàn)象,通??梢酝ㄟ^降低流動相pH、增加緩沖液離子強度,或添加競爭堿,如TEA,得到緩解。這些措施雖然減少了峰拖尾,但也可能給方法開發(fā)帶來挑戰(zhàn),如選擇性或分離度變差,降低柱壽命等。新的解決方案是用Eclipse Plus C18 固定相。它的硅醇基活性低,能為堿性化合物提供卓越峰形和柱效。


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