引言

　　近幾年來，雌性激素對水環(huán)境中影響越來越大，因?yàn)檫@些化合物在濃度低至0.1 gn/L 時(shí)，都會導(dǎo)致雄性魚的雌雄間性的變化。所以，需要一種具有靈敏度和選擇性高的分析方法用于復(fù)雜樣品中的雌性激素化合物的檢測。

　　三類化合物被確定為會導(dǎo)致內(nèi)分泌干擾的化合物，即天然產(chǎn)生的雌酮（E1），雌二醇（E2），和第三類合成雌激素－乙炔基雌二醇（EE2），它具有最高的內(nèi)分泌干擾作用。它們的結(jié)果參見圖1。

　　按照傳統(tǒng)的分析方法，這些化合物都是在與如七氟丁酸酐，五氟丙酸及許多硅烷化試劑衍生化之后，用GC/MS 或GC/MS/MS 檢測的。這種方法樣品前處理非常復(fù)雜，增加了樣品制備的時(shí)間。

　　使用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析雌激素，是不需要衍生化的。然而，單四極桿液質(zhì)技術(shù)在分析復(fù)雜基體樣品中如此低含量的雌激素時(shí)，其選擇性會有所限制。近來，飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF）技術(shù)的發(fā)展大大提高了TOF 的質(zhì)量分辨率，一般在250－300 amu 范圍內(nèi)，可以達(dá)到0.04 amu 的精確度。這個(gè)范圍適用于雌激素而且分辨率比四極桿質(zhì)譜高至少一個(gè)數(shù)量級。更高的質(zhì)量分辨率意味著降低樣品或基質(zhì)中非目標(biāo)化合物的干擾。質(zhì)量精度的提高可以得到化合物的精確質(zhì)量數(shù)，因而得到更高的分析選擇性[1,2]。

　　本文介紹了三種雌激素的檢測方法，包括樣品的保護(hù)、提取，凈化和用大氣壓光離子化－液相/飛行時(shí)間質(zhì)譜儀分析的所有步驟。其檢測限（LOD）小于0.1 ng/L 以及對于實(shí)際樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于15%，回收率高于90%。

樣品制備

　　在早期工作中，如果開發(fā)廣泛而實(shí)用的分析方法，樣品穩(wěn)定性是一個(gè)必須考慮的因素之一。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，保護(hù)劑可以滿足要求。

　　樣品制備中應(yīng)先加入保護(hù)劑，然后經(jīng)過三個(gè)制備步驟。所有的樣品制備都是全自動(dòng)的，幾乎不需要操作者介入。

　　第一步是固相萃取濃縮的步驟。在這一步，800 毫升水樣濃縮至4 毫升。

　　第二步是用正相色譜梯度洗脫，然后自動(dòng)收集相應(yīng)的餾分。制備液相采用Agilent 1100 制備液相系統(tǒng)，包括二元泵、控溫多孔板自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、可變波長檢測器和控溫餾分收集器。

　　第三步是采用體積排阻色譜（SEC），然后自動(dòng)收集相應(yīng)的餾分。

樣品保護(hù)

　　本應(yīng)用文獻(xiàn)中的樣品保護(hù)方法是在1 升樣品中加入0.25 克硝酸銅和1 毫升濃鹽酸。樣品被儲存于5℃的條件下（參見表2）。

樣品制備第一步

　　固相萃取柱（Baker）是添有200 毫克SDB1，體積是3 毫升。所有的步驟都是在Zymark AutoTrace 系統(tǒng)上全自動(dòng)進(jìn)行的。

　　每一個(gè)萃取柱序列用5 毫升乙酸乙酯，3 毫升甲醇和3 毫升色譜純的水活化。

　　1. 800 毫升樣品加入內(nèi)標(biāo)，然后以10 mL/min 的流速通過已近活化的固相萃取柱。污水樣品先用去離子水稀釋5 倍（即200 毫升稀釋至1000 毫升），然后加入內(nèi)標(biāo)。

　　2. 每一個(gè)固相萃取柱用3 毫升60% 甲醇，然后用3 毫升色譜純的水序列清洗。

　　3. 固相萃取柱用空氣干燥40 分鐘。

　　4. 2×1.5 毫升乙酸乙酯加入經(jīng)空氣干燥的每個(gè)固相萃取柱。收集洗脫液，最后再加入1 毫升乙酸乙酯。

樣品制備第二步

　　在這個(gè)步驟，采用正相色譜（NPC）和餾分收集。樣品萃取液在45℃下用氮?dú)獯蹈桑蠹s吹30－45 分鐘。然后溶解于0.25 毫升的環(huán)己烷：異丙醇（95:5）的溶液中，然后再用第三步進(jìn)一步凈化。

樣品制備第三步

　　在本步驟中，將采用體積排阻色譜（SEC）和餾分收集。從第二步來的樣品吹干（45℃），殘留物再用0.25 ml的二氯甲烷溶解，然后用下列的條件凈化：

　　收集的餾分經(jīng)氮?dú)獯蹈桑?5℃），殘留物再用0.2 毫升的甲醇:水（10:90）溶解。最后，準(zhǔn)備用液質(zhì)分析。

定性分析

　　所有的分析都是在安捷倫的液相色譜/飛行時(shí)間系統(tǒng)上進(jìn)行的。液相色譜/質(zhì)譜包括安裝大氣壓光離子源及Agilent 1100 液相色譜儀，以反相模式分析。1100 液相色譜由微量真空脫氣機(jī)，二元泵，柱溫箱，多孔板自動(dòng)進(jìn)樣器。另外一個(gè)單元泵用于輸入?yún)⒈入x子的導(dǎo)入。

結(jié)果和討論

校正標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

　　2 ng/L 標(biāo)樣的典型色譜圖參見圖2。對于800 pg 的柱上進(jìn)樣量，其信/噪比在200 到400 之間。檢測限約為20－40 pg 之間。

　　在這個(gè)反相色譜圖中，三個(gè)目標(biāo)化合物全部是基線分離。

　　采用內(nèi)標(biāo)化合物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校正曲線的建立。三個(gè)內(nèi)標(biāo)分別為氘代4 雌酮，氘代5 雌二醇和氘代4 乙炔基雌二醇。內(nèi)標(biāo)的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)分別為273.1798，276.2017和299.1954。

　　利用四點(diǎn)建立校正曲線，濃度分別為0，0.008，0.04和0.10 mg/L，所有標(biāo)準(zhǔn)溶液都含有濃度為0.02 mg/L的內(nèi)標(biāo)。校正標(biāo)樣最后相當(dāng)于0，2，10，25 ng/L，內(nèi)標(biāo)標(biāo)樣的濃度為5 ng/L。

雌酮的校正曲線見圖3。

穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

　　對于獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)的基本要求是要保證雌激素在樣品基質(zhì)中保證穩(wěn)定。若沒有樣品保護(hù)劑，化合物可能會快速降解，尤其在廢水中。結(jié)果參見表1。

　　從表1 的結(jié)果可以看出，在沒有加入保護(hù)劑時(shí)，兩天之后，雌激素有明顯的降解，雌酮和雌二醇降解最明顯，冷藏會降低化合物降解的速度。在有保護(hù)劑的條件下，化合物的常溫降解速度大大減慢，加上冷藏時(shí)，在15 天內(nèi)，只有低于10% 的雌激素降解。數(shù)據(jù)結(jié)果參見表2。

　　圖4-9 所示為提取離子流色譜圖的例子。

回收率和精密度數(shù)據(jù)（%RSD）

　　用11 批次的樣品進(jìn)行分析方法的驗(yàn)證。樣品包括添加0.1，2.0 或20.0 ng/L 的去離子水，河水，另外添加2.0 或20.0 ng/L的河水，最后流出廢液樣品，和另外添加2.5 或15 ng/L 最后流出廢液樣品，污水和添加25 ng/L的污水樣品，詳細(xì)地參見表3。

樣品背景水平

檢出限（LOD）和定量限（LOQ）

　　檢出限（LOD）：整個(gè)樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差× 4.65
　　定量限（LOQ）：精密度× 2 + 偏差（Bias）

精確質(zhì)量數(shù)測定和質(zhì)譜圖測定

　　可以通過測量各種基質(zhì)樣品中的雌激素的精確質(zhì)量數(shù)來得到方法的選擇性。將測量的質(zhì)量數(shù)或絕對偏差與理論值比較。偏差越小，可信度越高。質(zhì)量偏差受樣品基體背景及共流出峰的影響。對于測定的三個(gè)雌激素，10 ppm 相當(dāng)于0.003 質(zhì)量單位的誤差。在負(fù)離子模式下，測定的三個(gè)雌激素的精確質(zhì)量數(shù)如下：

　　表5 所示為在各種基質(zhì)樣品中，測定的三個(gè)雌激素的質(zhì)量誤差。數(shù)據(jù)是來自方法驗(yàn)證的那批樣品的數(shù)據(jù)。

結(jié)論

　　方法的目的是得到每一個(gè)雌激素的定量限（LOQ）。所有的結(jié)果總結(jié)于表4 中。對于各個(gè)雌激素的定量限，乙炔基雌二醇，好于0.03 ng/L，雌二醇，好于0.3 ng/L和雌酮，好于1 ng/L。

　　回收率在89.4－108.9% 之間，對于河水和最后流出物的精密度優(yōu)于15% RSD。對于測量的質(zhì)量數(shù)精度，除了兩個(gè)污水樣品之外，所有的數(shù)據(jù)的質(zhì)量精度均小于5 ppm， 所以結(jié)果具有很高的可信度?？偟膩碚f，此分析方法具有高靈敏度，高選擇性的優(yōu)點(diǎn)。