個人覺得有用，分享下

做了一陣子液相，慢慢的從無到有，從0到有些感性和理性的認識，常常有中感覺，或者是大徹大悟，或者是茅塞頓開，或者是有些慨然。。。覺得有必要寫下來，算是個人的一些偶得和體會，希望能夠?qū)ο笈家粯拥眯率钟兴鶈l(fā)和幫助。

HPLC分析大致說來由三部分組成：樣品制備，液相條件摸索，數(shù)據(jù)處理。

前兩者是決定性得，raw data出來了，任怎樣處理，只是修飾性得工作，當(dāng)然REPORT做得漂亮，也是很重要得，畢竟是直接給人看得。

1、樣品制備

往往很多時候人們忽略樣品制備得重要性，尤其是對于中藥。偶就是這樣子，一上來只想的去摸條件，去改變儀器得東東，卻忽視了一旦樣品制備了，很多決定性得東西就在里面，任你色譜條件如何都改善和美化不了得。更而且，好得樣品處理方法可以省去液相很多麻煩。想想也是，畢竟很多時候一個好得條件真的很難得，然而卻可以在樣品前處理或制備過程中解決掉。如果偶做得多了，有了例子來證明，也許更有說服力。偶會注意積累的。

樣品的制備主要包括以下幾個內(nèi)容：

• 樣品采集：對于中藥，如果以制定質(zhì)量標準為目的，則需要注意采集時間，地點，部位，甚至規(guī)格
• 樣品保存：常常我們不會在采集到后馬上處理，所以要注意樣品的保存，一般偶覺得應(yīng)該陰干后放到干燥通風(fēng)處，如果是特殊樣品則需特別處理。
• 樣品提取制備
• 樣品凈化：包括一系列的處理過程，有時候和提取是同步的
• 樣品最后所用溶劑

偶覺得選擇最優(yōu)條件的原則有如下：

A）目的是定性還是定量，或者半定量：若定性，則不要求提的非常干凈；若定量，則要注意是否提取完全

B）是檢測某一類，某一個化合物還是，還是什么都要。這和定性定量有相通之處。前兩者要求針對這種化合物，這類東東選擇溶劑，而后者則是選擇一個盡可能都提的出來的溶劑，比如甲醇。這一項同樣也決定了提取方法。比如揮發(fā)油類一般用SOXLET

C）在可以的情況下，盡可能選擇和流動相相同的溶劑溶解樣品。當(dāng)然一般開始沒有摸色譜條件時不知道哪個溶劑系統(tǒng)適合，但是當(dāng)流動相確定后則可以反過來調(diào)整。這樣可以盡量避免溶劑峰。

1、換柱子時不要心不在焉哦，不然很容易忘記注意FLOW的方向。。。

2、注意記錄，每個色譜圖對應(yīng)的色譜條件，以備將來查閱。詳盡的試驗記錄是個好的習(xí)慣，偶就是開始大大咧咧什么都沒記，到后來才去一個一個的看，查對，F(xiàn)T，真的會暈的。現(xiàn)在老老實實記錄，不會花費多少時間，永遠不要過于自信自己的記性哦

3、如果是PDA記得觀察你的譜圖是在哪個波長下哦，偶就是本該在203下看的，卻忘記選擇波長，于是看到很令人傷心的譜峰，幸虧后來發(fā)現(xiàn)了，及時更正，塞，多好的條件啊，差點錯過，汗。。。。

4、經(jīng)常檢查洗針和洗泵頭的瓶子里是否空了，因為它們的消耗量也是很大地。。。。不然。。。針不能洗了，你說會有什么后果哩？？？


關(guān)于液相的經(jīng)濟帳

偶不是很多考慮經(jīng)濟的問題，但是有時候仔細想想這個帳的意義還是很大的

很多人不喜歡用乙腈，原因有三：1）毒，雖然甲醇也毒。2）貴。3）難回收，這個是針對制備。

但是乙腈卻有它自己的優(yōu)點：

1）對UV檢測干擾小，尤其是邊緣吸收的化合物，可在185－205范圍內(nèi)檢測

2）粘度小，柱壓底，溶劑強度稍高

3）乙腈雖然毒，但是它的毒性僅為拋光醇的十分之一。

4）雖然貴，但是分析一個樣品的造價僅比甲醇高2－4％（根據(jù)文獻）

所以，這樣看下來，乙腈還是很好地。。。。

還有呢，就是國產(chǎn)還是進口的問題。偶覺得，開始覺得當(dāng)然是進口好啊，但是現(xiàn)在不這樣認為了。第一：摸條件本身就是試驗，拿進口色譜純的乙腈一瓶一瓶灌，時間長了才發(fā)現(xiàn)用的不少呀，可不比灌水咯； 第二：兩者相差價格太大，太大。也許可以用國產(chǎn)的摸好條件再用進口的。。。。不過有些羅嗦，而且一個液相的大拿曾經(jīng)和偶說：進口，國產(chǎn)，差不多，區(qū)別就是國產(chǎn)地要濾濾干凈，進口地似乎好些，可以省事。。。。汗。偶寧愿多勞動，省很多呢

不過突然想到前面提到的這個想法可以在制備上用。制備真的好費好費，F(xiàn)T,簡直是喝溶劑，雖然在分析上摸條件好了，但是制備上還是有不同，需要再摸的，所以可以用國產(chǎn)。。想到偶當(dāng)初一瓶瓶的灌進口不知灌了多少瓶，

再汗ING

Some tips:

1.generally, when we run a sample set, i think its better for us to set the injection times of the first row to be 2 because i have met some conditions that all the samples in the same sample set has a perfect reproducibility but the first one. i think there r many factors involved in, such as the condition of the colomn and the UV lamp, or the suitibility of the whole system. so, i consider its a better choice for us to let the first sample run two times to achieve a good result. it is a good method for us to check out wether the variety between the first row and the others comes from the sample itself or comes from our system unstability.

2. very often the injection volumne is 10 ul in HPLC. but in my own experience, i have to inject some volumes like 1,2,3,4 ul, and i found that the accuraccy is poor, although i got a R and R^2 of something like 0.9998, especially when the injection volume is below 1 ul, the accuraccy is too poor to be trusted and validated. so, its reasonable to inject the common 10ul i think, and better for us to avoid a small injection volume.

3.when we make sample preparation, better for us to chose glass flask and bottles but avoid the plastic ones, especially when we prepare standard liquid in which there are small amount of standards and easily to be affected by impurity.

4.是這樣子的。最近做液相，重現(xiàn)性不是很好。不知道是什么原因開始。在丁香里也看到很多戰(zhàn)友的重現(xiàn)性不好的。保留時間倒是沒問題，問題出在峰面積，差異比較大。后來終于發(fā)現(xiàn)了，因為自己偷懶，每次都沖到?jīng)]峰出來，就直接用下次的初始條件平衡。但是分離度總會有差異。如果每次用甲醇沖足夠的時間，再平衡足夠的時間，問題就解決了?？磥?，偶這種偷懶是非常非常地不可取的哦。。。大家不要學(xué)我。。。。因為真的浪費了好多時間啊。。。。

1）定量中常常遇到這種情況，要確定對照品的峰?？梢詤⒖嘉墨I。但是在自己做的時候，最好還是驗證一下。如何驗證呢，就是把標準品加入到樣品中去，看看哪個峰增強了。當(dāng)然，還要考察不同的流動相條件，看是否一個風(fēng)變成了兩個峰。這是偶失敗后得出的結(jié)論。因為難排除剛好在你的色譜條件下兩個不同的化合物RT相同的情況。當(dāng)然，它們的紫外光譜也是個參考。但如果都是同類化合物，如皂甙的話，就難說了。偶覺得這一條很中藥，真的很重要。。。。。。。。。。。。。。。

2）定量分析的樣品前處理中，盡量減少操作步驟。偶的意思是，如果可以一下子稀釋30倍，就不要先稀釋6，再稀釋5，因為這樣在操作取樣過程中很多損失的可能。很淺顯的道理，但是，偶是犯了錯誤才想到的。
P.S.:選擇適當(dāng)?shù)娜萜骱鸵埔悍椒ㄒ埠苤匾?，比如同樣?0ML，用注射器就比用移也管要準確。

3）關(guān)于做定量：
如果等度可以得到滿意的分離效果，盡量不要用梯度，梯度是實在沒有辦法的選擇。因為即使有柱溫箱，由于泵的混合或者流動相變化也會引起基線漂移或者RT變化，是件很麻煩的事情