前一篇博文《食品中殘留物定性首選色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術》介紹了應用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術對食品中殘留有機化合物的定性分析。本文同前一篇博文一樣，以歐盟指令和國家標準規(guī)定為依據(jù)，結合實際檢測工作，就色譜及色譜-質(zhì)譜定量時應注意的一些問題和體會做一交流。

按照前文介紹的色譜-質(zhì)譜檢測方法已對食品中某殘留被測物定性無誤了，接下來還要對檢出物進行定量分析。目前根據(jù)歐盟指令，將殘留物分為禁用物質(zhì)和限用物質(zhì)。禁用物質(zhì)執(zhí)行最低要求執(zhí)行限（Minimum Required Performance Limits，MRPL），如：《農(nóng)業(yè)部公告禁用獸藥目錄》等標準和法規(guī)。對于這類物質(zhì)基本上是以檢驗標準方法檢出限作為是否檢出的判定依據(jù)。限用物質(zhì)執(zhí)行最大殘留限量（Maximum Residue Limits，MRL），如：《GB 2760—2014，食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》、《GB 2762-2012 食品安全國家標準 食品中污染物限量》、《GB 2763—2016，食品中農(nóng)藥殘留最大限量》等標準和法規(guī)中都不僅規(guī)定了要檢測的物質(zhì)，還規(guī)定了被測物的檢出限（MRL）。被測物最終結果檢出的值超過標準規(guī)定的MRL值將視為檢出，即為陽性結果。因此，被測物準確定性后的準確定量在最終出具的檢測報告中同等重要。

在《執(zhí)行關于96/23/EC指令分析方法程序和結果解釋的歐盟委員會2002/657/EC指令》、《食品和飼料中農(nóng)藥殘留分析質(zhì)量控制和驗證程序SANCO/12571/ 2013指令》兩個指令及《GB/T 27404—2008，實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化部分》國家標準中，對殘留檢測方法的檢出限、準確度、精密度、回收率等分析學指標做了詳細規(guī)定。根據(jù)這些規(guī)定并結合實際工作就定量時應注意的事項歸納如下：

1.      標準物質(zhì)。

根據(jù)《食安法》第五十七條規(guī)定：“食品檢驗機構按照國家有關認證認可的規(guī)定取得資質(zhì)認定后，方可從事食品檢驗活動?！痹趯嶒炇艺J證認可評審中標準物質(zhì)（過去實驗室稱為標準品）是重要考察因素之一，它直接關系到最終定量檢測結果是否準確。所以，實驗室管理手冊都會有專門一節(jié)描述對標準品的管理和使用。

認證認可實驗室采用的殘留分析用的標準物質(zhì)均為有證標準物質(zhì)（Certified reference material, CRM），產(chǎn)品應附有企業(yè)通過的質(zhì)量認證證書、已知純度、產(chǎn)品檢測報告、不確定度、有效期證書和產(chǎn)品說明書等。實驗室應建立標準品目錄，記錄接收日期登記、驗收記錄和使用記錄等。要按照所附產(chǎn)品說明書的保存條件存放標準品，絕大部分標準品都要求低溫下儲存，最好存放在冰箱里，避光和防潮，最大限度地減少降解率。很多標準品在前述條件下可以儲存較長時間，大于供應商的有效期。在國外，通常用新有證標準物質(zhì)對其純度進行檢驗后若沒有變化是可以繼續(xù)進行使用的，只要有完整的測試報告和記錄。但若某一被測目標物檢出需要精確定量時最好用新標準品。不過在國內(nèi)實驗室認證評審時，有些評審員只接受帶原廠證的標準品，而不接受實驗室自己檢測驗證過的標準品。所以在國內(nèi)實驗室認證前最好還是換新的標準品吧，避免不必要的麻煩。雖然這樣做造成了浪費和污染。

配制標準（包括內(nèi)標標準）儲備液稱量標準品時一般采用萬分之一天平稱量，稱取量不少于10mg。儲備液容器標簽要標明品名、濃度、溶劑、配制日期和配制人并在有效期內(nèi)保存于低溫避光容器內(nèi)，還應該防止溶劑損失和防潮。有一種專門用于存放標準儲備液的雙磨口儲液瓶（見圖1.），價格比較貴，但重要的標準儲備液可以考慮選用。通常根據(jù)分析方法選擇溶解、定容溶劑。在建立新方法時，要根據(jù)被測物和檢測儀器特性合理選擇溶解、定容溶劑。工作液系列的配制要根據(jù)限量要求和方法學規(guī)定確定，容器標簽同樣必須標明名稱、濃度、溶劑、配制日期和配制人并在有效期內(nèi)保存于低溫避光容器內(nèi)，還應該防止溶劑損失和防潮。

              

圖1. 存放標準儲備液雙磨口儲液瓶

2.      有證標準樣品

有證標準樣品是指特定樣品中分析物被賦值，例如：雞肉中的氯霉素。由于有證標準樣品被視為是特定樣品中特定分析物的定值，所以它主要用做日常檢驗的質(zhì)控樣品。與標準品添加到樣品中做回收相比，采用標準樣品是對分析方法全過程進行驗證，而標準品添加回收實際上沒有驗證提取效率這一步。因此，考核一個新檢測方法設計的是否合理，特別是提取效率是否滿足檢測要求，最好選用有證標準樣品。有證標準樣品通常是由國家計量部門或由國家計量部門批準、頒布并授權生產(chǎn)。購買時一定要仔細查看證書的有效性。有證標準樣品雖然是最理想的質(zhì)控樣品，但是目前能提供的品種還比較少，日常檢測質(zhì)控更多的還是采用標準品添加回收。

3.      定量方法

（1）         內(nèi)標法。定量首選方法。若是色譜分析內(nèi)標物可以考慮選擇同系物，若是色譜-質(zhì)譜分析則首先考慮選擇與被測物化學結構相同的穩(wěn)定同位素做內(nèi)標物。內(nèi)標物應在分析實驗的第一步（一般是提?。┚图舆M去，這樣可以校正整個分析過程（除提取誤差外）所產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差。有兩個小建議供參考：其一，對于多殘留分析需要選擇多個內(nèi)標法（對于殘留獸藥最好是一對一），用一個內(nèi)標物校正所有被測物質(zhì)往往不如用外標法定量更準。其二，對于檢測的被測物絕對回收率低于方法學規(guī)定的回收率要求，但回收率較穩(wěn)定，可以采用內(nèi)標法用相對回收率將其回收率提高到方法學規(guī)定要求范圍內(nèi)。而且內(nèi)標法可以提高殘留分析方法的重現(xiàn)性，在沒有內(nèi)標的情況下，重現(xiàn)性RSD常常會高于20%；而當使用內(nèi)標時，RSD能降低到5%左右。在用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測時常常由于基質(zhì)效應，回收率有時會較低，用內(nèi)標法可以校正達到方法學要求。雖然良好的實驗室規(guī)范（GLP）認為衡量一個方法的是否可用應該用絕對回收率，但是，隨著檢驗工作量的增加，隨著儀器性能的提高，日常檢測用相對回收率完全可用滿足檢測需求，同時提高了工作效率，降低了工作強度。

（2）      外標法。采用外標法定量，通常要做定量校準曲線。殘留分析建立的曲線至少應有5點（在接近方法檢出限時可以包括零點）。其中，校準液系列的最低點濃度應為最低校正水平（LVL），該點通常與分析方法的最低檢出限相當，或者為低于相應報告限（RL）的濃度水平。RL不能低于最低定量限（LOQ）。在應用標準曲線定量時需關注這幾個問題：

（i）         檢測的被測物含量必須在定量曲線范圍內(nèi)，接近方法檢出限曲線的濃度范圍至少覆蓋一個數(shù)量級。

（ii）       應描述曲線的計算公式，曲線數(shù)據(jù)擬合度應滿足指令和標準要求。

（iii）     應考慮曲線參數(shù)的適用范圍。例如，采用LC-MS/MS檢測時往往會有基質(zhì)效應，所以，當以某一種基質(zhì)液配置的定量標準曲線可能不適用另一種基質(zhì)的定量，如：牛肉基質(zhì)的氯霉素標準曲線，可能不適用蝦中氯霉素的定量。如圖2. 所示，由于基質(zhì)效應的影響，在相同的響應值時，標準液與實際樣品的含量可能是不同的。不同基質(zhì)的樣品響應值也會存在差異。B含量可以比A（標準品）高，也可以比A低。

              

圖2. 由于基質(zhì)效應的影響，在相同響應值時標準液與實際樣品的含量可能不同

（3）      標準曲線添加法。有些被檢測的有機污染物在食品中普遍存在，如烘焙食品中的丙酰胺，很難找到空白樣品，這時樣品中殘留物的定量通常采用標準添加法。另外，現(xiàn)在認可實驗室都要參加相關的實驗室比對實驗或盲樣測試，一般僅提供測試樣品，并不提供對應的空白基質(zhì)樣品。這時要得到比較好的定量數(shù)據(jù)可以考慮采用標準曲線添加法。

4.      補充幾個與定量分析相關的問題

（1）      要得到食品中殘留有機物定量分析的準確數(shù)據(jù)，實驗室應有運轉(zhuǎn)正常的質(zhì)量保證體系，確保分析過程的每一步都有相應的質(zhì)量控制。整個分析過程包括：取樣、樣品傳遞、制樣、儲存、提取、凈化、標準物質(zhì)及標準溶液（或是帶證標準樣品）、儀器檢測等，都是受控的。所有步驟都會對最終的定量準確度產(chǎn)生影響。

（2）      標準液配制要注意：

（i）          避免使用易揮發(fā)的有機溶劑，如乙醚等。

（ii）        目前國內(nèi)許多實驗室采用容量瓶儲存標準液，由于有些容量瓶的磨口密封性不是很好，所以通常需要用封口膜再密封一下。

（iii）      多種農(nóng)殘儲備液混合時，要注意避免可能存在的彼此反應。

（3）      殘留分析基本上都有相關法律法規(guī)限量要求，因此，分析方法也都對應有推薦標準或指令，最終出具的結果數(shù)據(jù)必須完全符合相關方法學標準規(guī)定的要求。

（4）      由于殘留分析含量都很低，在整個分析過程中都要避免交叉污染。所以，為保證數(shù)據(jù)準確和對異常數(shù)據(jù)的判斷，每批分析都必須帶質(zhì)控點，即：試劑空白、樣品空白、質(zhì)控樣品（樣品標準添加回收）、標準曲線（內(nèi)標標準）等，這些數(shù)據(jù)可以對最終數(shù)據(jù)準確度的判斷提供幫助。

（5）      最好建立質(zhì)控圖，有助于發(fā)現(xiàn)異常數(shù)據(jù)。