細(xì)胞培養(yǎng)(MTT,Transwell，轉(zhuǎn)染,RNAi干擾)
細(xì)胞增殖與毒性檢測（MTT/CCK8）
MTT技術(shù)服務(wù)
四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT方法），是通過快速簡便的顏色反應(yīng)來檢測細(xì)胞存活數(shù)量。其原理是MTT可作為哺乳類動(dòng)物細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶的底物。當(dāng)有活細(xì)胞存在時(shí)，線粒體內(nèi)琥珀酸脫氫酶可將淡黃色的MTT還原成藍(lán)紫色的針狀甲月替(Formazan)結(jié)晶并沉積在細(xì)胞中，結(jié)晶物能被二甲基亞砜 (DMSO)溶解,用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm波長處測定其吸光度OD值，OD值的高低可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量及其活性。
目前MTT法常用于以下幾個(gè)方面的研究：
1、檢測細(xì)胞活性：常作為細(xì)胞毒性試驗(yàn)的一種方法。
2、體外藥物敏感實(shí)驗(yàn)：該方法簡便、經(jīng)濟(jì)、快速，重復(fù)性好，所需的細(xì)胞數(shù)較少，沒有***性，目前廣泛的用于臨床前的抗癌藥物的篩選研究。
3、一些細(xì)胞因子活性的研究
客戶方需提供:
樣本描述,相關(guān)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)內(nèi)容如作用時(shí)間和樣本濃度等。
公司方提供：
實(shí)驗(yàn)結(jié)果IC50值。
實(shí)驗(yàn)周期與費(fèi)用：
實(shí)驗(yàn)費(fèi)用以樣本數(shù)和細(xì)胞株的種類數(shù)目為單位計(jì)算，實(shí)驗(yàn)周期為21個(gè)工作日，公司將在材料和預(yù)付的實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)全部到位的工作日后30個(gè)工作日之內(nèi)提交實(shí)驗(yàn)結(jié)果?？蛻粜柙谑盏綄?shí)驗(yàn)結(jié)果后一周內(nèi)付清所有剩余款項(xiàng)。
收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)：
每個(gè)樣本，1株細(xì)胞的IC50值500元。
Transwell(遷移侵襲、共培養(yǎng))
轉(zhuǎn)染
常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類，一類是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（永久轉(zhuǎn)染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動(dòng)子和其它調(diào)控元件的分析。一般來說，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后24-72小時(shí)內(nèi)（依賴于各種不同的構(gòu)建）分析結(jié)果，常常用到一些報(bào)告系統(tǒng)如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來幫助檢測。后者也稱穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合，通常需要通過一些選擇性標(biāo)記，如來氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B***酸轉(zhuǎn)移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。
轉(zhuǎn)染技術(shù)的選擇對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果影響也很大，許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化DNA與轉(zhuǎn)染試劑比例，細(xì)胞數(shù)量，培養(yǎng)及檢測時(shí)間等。一些傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，如DEAE右旋糖苷法，***酸鈣法，電穿孔法，脂質(zhì)體法各有利弊，其主要原理及應(yīng)用特點(diǎn)見下表：
RNAi干擾
RNA干擾（RNA interfering，RNAi）現(xiàn)象是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA引發(fā)的廣泛存在于生物體內(nèi)的序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后的沉默過程。由于RNAi具有高度的序列專一性和有效的干擾，可以特異地將特定的基因沉默，從而獲得基因功能喪失或基因表達(dá)量的降低，因此可以作為功能基因組學(xué)的一種強(qiáng)有力的研究工具。RNAi技術(shù)可廣泛應(yīng)用到包括功能學(xué)，藥物靶點(diǎn)篩選，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路分析，疾病治療等等。我們可對(duì)靶基因序列進(jìn)行干擾位置效應(yīng)評(píng)價(jià)和序列同源型分析，完成siRNA/shRNA/miRNA等多種序列的設(shè)計(jì)，并提供從siRNA合成、RNAi載體構(gòu)建到RNAi相關(guān)的病毒包裝、RNAi功能驗(yàn)證等全面的RNAi解決方案。
※ RNAi服務(wù)類別
1、siRNA
對(duì)于瞬時(shí)基因沉默實(shí)驗(yàn)，化學(xué)合成siRNA的方法操作簡便，容易獲得高水平的瞬時(shí)沉默效果，特異性強(qiáng)。我們通過嚴(yán)格設(shè)計(jì)來增強(qiáng)siRNA的專一性；針對(duì)某靶基因設(shè)計(jì)的3條siRNA可保證其中兩條的Knockdown效率達(dá)到70%（在轉(zhuǎn)染效率大于80%的情況下）。
1.1 普通siRNA：均由HPLC純化，100％除去尚未配對(duì)的單鏈
1.2 化學(xué)修飾siRNA：利用2’-Fluoro或2’－OMe修飾以提高siRNA在血清和培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性；作用時(shí)間長于普通siRNA
1.3 熒光標(biāo)記siRNA
2、RNAi載體
RNAi載體表達(dá)可以長時(shí)間穩(wěn)定地研究基因功能，載體在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)可達(dá)數(shù)星期甚至更久。
miR-RNAi載體構(gòu)建－利用細(xì)胞內(nèi)源性的miRNA加工機(jī)制，相比傳統(tǒng)shRNA載體可更高效地表達(dá)RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并具有采用EmGFP進(jìn)行表達(dá)追蹤和順式表達(dá)多個(gè)miRNA的優(yōu)點(diǎn)。針對(duì)人類、大鼠、小鼠的大多數(shù)基因預(yù)先設(shè)計(jì)好了miRRNAi序列，每個(gè)基因設(shè)計(jì)的4條 miRRNAi Select序列我們保證至少有2條可以達(dá)到至少70%轉(zhuǎn)錄水平的knockdown（在轉(zhuǎn)染效率>80%的前提下）。
2.2 shRNA載體構(gòu)建—設(shè)計(jì)針對(duì)特定基因的shRNA序列，并將其連入組成型pENTR™/U6或誘導(dǎo)型pENTR™/H1/TO載體中。
3、RNAi導(dǎo)入優(yōu)化
由于siRNAs是進(jìn)入細(xì)胞后才能對(duì)蛋白的表達(dá)進(jìn)行抑制，因此如何高效地將siRNAs轉(zhuǎn)入細(xì)胞也是成功抑制基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟。例如，一個(gè)siRNA分子對(duì)某特定基因的抑制效率為90%，而轉(zhuǎn)染效率為10%，那么zei后抑制蛋白表達(dá)zei后的效率只有9%，可見如何提高siRNAs的導(dǎo)入效率非常重要。
3.1 RNAi轉(zhuǎn)染優(yōu)化－為了使得RNAi實(shí)驗(yàn)獲得zei大化的干擾效果，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑技術(shù)，針對(duì)多種真核生物細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染參數(shù)的優(yōu)化。RNAi 熒光標(biāo)記的陰性對(duì)照、陽性對(duì)照可以用于進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率的優(yōu)化。
3.2 病毒侵染優(yōu)化－針對(duì)難于轉(zhuǎn)染細(xì)胞（特別是神經(jīng)細(xì)胞、懸浮細(xì)胞、干細(xì)胞）和In vivo實(shí)驗(yàn)，基于的RNAi病毒載體構(gòu)建、包裝、濃縮等技術(shù)，利用腺病毒或慢病毒進(jìn)行RNAi研究
3.3篩選RNAi穩(wěn)定細(xì)胞株－利用抗生素來篩選穩(wěn)定表達(dá)shRNA或miRNA的細(xì)胞株
4、RNAi干擾效果檢測
用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測mRNA水平的基因敲減效果；通過Wester blot方法檢測蛋白水平的基因敲減效果
※ microRNA干擾載體構(gòu)建
※ 原理
miRRNAi 表達(dá)載體采用Pol II啟動(dòng)子表達(dá)人工設(shè)計(jì)的微小RNA (miRNA), 后者從長的轉(zhuǎn)錄本被加工，進(jìn)而導(dǎo)致特異性的mRNA的降解。利用其在分子和細(xì)胞生物學(xué)以及基因調(diào)節(jié)的專有技術(shù)，為選擇好的靶標(biāo)設(shè)計(jì)微小RNA (miRNA)序列，并將其克隆入Pol II miRRNAi 表達(dá)載體。
※ 服務(wù)流程
1 針對(duì)特定基因，設(shè)計(jì)B Pol II miRRNAi序列；合成該序列并退火生成雙鏈DNA；
2 將DNA與pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR載體相連，連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌
3 測定全長序列以鑒定miRNA序列的正確性
4 制備甘油菌
5 提供數(shù)據(jù)分析和報(bào)告給客戶
※ 客戶提供
只需提供您研究基因的ID
※ 我們提供
構(gòu)建好的Pol II miRRNAi表達(dá)載體和相應(yīng)的甘油菌；贈(zèng)送陰性對(duì)照甘油菌
※ 質(zhì)量保證
若您購買一套克?。ㄡ槍?duì)一個(gè)基因的不同位置設(shè)計(jì)4條miRNA序列），在轉(zhuǎn)染效率>80%的前提下，我們保證至少有2個(gè)克隆可以達(dá)到至少70%轉(zhuǎn)錄水平的knockdown。
※ 服務(wù)價(jià)格：詢價(jià)（四個(gè)克隆和一個(gè)陰性對(duì)照）
※ 完成時(shí)間:2周(10個(gè)工作日)
細(xì)胞培養(yǎng)(MTT,Transwell，轉(zhuǎn)染,RNAi干擾)價(jià)格
細(xì)胞培養(yǎng)(MTT,Transwell，轉(zhuǎn)染,RNAi干擾)信息由湖北百奧斯生物科技有限公司為您提供，如您想了解更多關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)(MTT,Transwell，轉(zhuǎn)染,RNAi干擾)報(bào)價(jià)、型號(hào)、參數(shù)等信息，歡迎來電或留言咨詢。
移動(dòng)版：