EAD Talk | 文獻(xiàn)分享：分子網(wǎng)絡(luò)-電子活化解離（EAD）技術(shù)增強(qiáng)代謝物注釋

SCIEX

2024.4.03

中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所許國旺研究員的實驗室，近期在analytical chemistry (IF 7.4)上發(fā)表文章，題目為“Enhancing Metabolome Annotation by Electron Impact Excitation of Ions from Organics-Molecular Networking”。創(chuàng)新性地提出，將有機(jī)物離子電子碰撞激發(fā)（EIEIO, electron impact excitation of ions from organics）碎裂技術(shù)和分子網(wǎng)絡(luò)（MN）進(jìn)行結(jié)合，大大加強(qiáng)了非靶代謝研究中代謝物的注釋工作。

背景介紹

基于高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜（HPLC-HRMS）的非靶向代謝組學(xué)研究已成為不同領(lǐng)域不可或缺的工具，如：疾病診斷、環(huán)境科學(xué)、食品安全等。質(zhì)譜技術(shù)的創(chuàng)新進(jìn)展大大提高了代謝組學(xué)的研究能力。然而，大規(guī)模、高精度的代謝物標(biāo)注仍然是代謝組學(xué)研究的瓶頸，限制了對代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的全面理解和利用。

電子活化解離（EAD， electron activated dissociation）是基于電子介導(dǎo)的碎裂技術(shù)，包括三種解離模式，如電子捕獲解離（ECD， electron capture dissociation）、熱電子捕獲解離（Hot-ECD）和有機(jī)物離子的電子碰撞激發(fā)（EIEIO）。不同于ECD碎裂，EIEIO專為單電荷分子碎裂而設(shè)計。EIEIO能利用相對較高能量的電子（>10 eV）激發(fā)分子離子的電子態(tài)，導(dǎo)致同質(zhì)裂解，形成具有未配對電子的自由基產(chǎn)物。但由于缺乏參考的EIEIO MS/MS數(shù)據(jù)庫，目前還沒有針對EIEIO非靶向代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的全球代謝組注釋。在推進(jìn)非靶向代謝組學(xué)分析的過程中，迫切需要充分利用EIEIO的潛力。

分子網(wǎng)絡(luò)（MN）對非靶向代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的可視化和注釋具有獨特的優(yōu)勢。該課題引入了結(jié)構(gòu)引導(dǎo)分子網(wǎng)絡(luò)策略（SGMNS）。該方法利用從代謝物結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中提取的化合物分子指紋相似性來構(gòu)建分子網(wǎng)絡(luò)。SGMNS整合了基于網(wǎng)絡(luò)的代謝物注釋和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫的優(yōu)勢，使用幾個初始種子代謝物，就能有效地注釋成千上萬的代謝物。該團(tuán)隊提出了一種新方法，將EIEIO和MN結(jié)合起來，以加強(qiáng)代謝物標(biāo)注，并將建立的方法應(yīng)用于前列腺癌研究。

分析與討論

EIEIO和CID模式下代謝產(chǎn)物片段庫的構(gòu)建

EIEIO參考MS/MS數(shù)據(jù)庫的缺乏，這點給使用LC-EIEIO-MS/MS注釋非靶向代謝組學(xué)數(shù)據(jù)帶來了巨大挑戰(zhàn)。文中構(gòu)建了EIEIO和CID模式下的代謝物片段庫，其中包括ESI+和ESI?電離模式下的母離子m/z、Rt和MS/MS圖譜信息。該片段庫可用來注釋代謝物，研究EIEIO的碎片特征以及譜圖相似性與結(jié)構(gòu)相似性的關(guān)聯(lián)。

代謝物的EIEIO碎裂，基于電子誘導(dǎo)解離機(jī)制，與廣泛使用的低能CID模式相比，EIEIO產(chǎn)生的碎片離子更豐富，與結(jié)構(gòu)信息的聯(lián)系更緊密。該團(tuán)隊以三種典型的參考代謝物（如脫氧腺苷酸、棕櫚酰肉堿和瓜氨酸）為例(Figure 1)。闡述了EIEIO的碎裂模式和特點，研究也表明EIEIO產(chǎn)生的碎片離子數(shù)量明顯多于CID模式。

Figure 1.?MS/MS spectra and potential fragmentation pathways of deoxyadenylic acid (a) and palmitoylcarnitine (b) in CID and EIEIO modes. Each spectrum is labeled with the corresponding count of fragment ions (no. of FI). The fragment ions appearing in both dissociation modes are marked in red, and the fragment ions specific to the EIEIO mode are in blue. The precursor ions were hidden in the EIEIO spectra.

結(jié)構(gòu)相似性和譜圖相似性的關(guān)聯(lián)

普遍認(rèn)為，具有相似結(jié)構(gòu)或亞結(jié)構(gòu)的化合物很可能擁有相似的質(zhì)譜MS/MS圖譜?；谶@一假設(shè)，人們提出了各種分子網(wǎng)絡(luò)方法，如GNPS、SGMNS和KGMN等，用于非靶向代謝物標(biāo)注。為了全面發(fā)揮分子網(wǎng)絡(luò)注釋代謝物的優(yōu)勢，加強(qiáng)Sim1（結(jié)構(gòu)相似度）和Sim2（譜圖相似度）之間的相關(guān)性至關(guān)重要。針對已建立的參考MS/MS數(shù)據(jù)庫，使用CID和EIEIO模式獲取的MS/MS圖譜探討了Sim1和Sim2之間的相關(guān)性；并對來源于ESI+和ESI?電離模式下的55,945和52,650對代謝物，進(jìn)一步評估。結(jié)果表明：與ESI+ CID模式相比，ESI+ EIEIO模式中Sim1（結(jié)構(gòu)相似度）和Sim2（譜圖相似度）的相關(guān)性更強(qiáng)。此外，還評估了CID和EIEIO MS/MS圖譜之間的相似性，結(jié)果表明：CID參考譜圖并不適合注釋EIEIO譜圖。

對于4374對結(jié)構(gòu)相似代謝物，在CID和EIEIO模式下的比較結(jié)果表明：EIEIO增強(qiáng)了Sim1和Sim2之間的相關(guān)性，尤其是有機(jī)氧化合物（如糖酸及其衍生物、氨基糖、單糖和糖基化合物）和脂類及類脂分子（如類固醇及其衍生物、脂肪?；⑶跋┐贾透视椭?。不過，EIEIO模式中，核苷、核苷酸和類似物的相關(guān)性低于CID模式。

EIEIO?譜圖相似性網(wǎng)絡(luò)評估

譜圖相似性網(wǎng)絡(luò)（如GNPS)已被證明是一種從非靶代謝組學(xué)數(shù)據(jù)中捕捉結(jié)構(gòu)類似物的有效方法。通過利用在ESI+ EIEIO和CID模式下獲得的上述參考MS/MS圖譜，建立了EIEIO和CID圖譜相似性網(wǎng)絡(luò)。譜圖相似性評估結(jié)果顯示，在對結(jié)構(gòu)相似的代謝物進(jìn)行聚類方面，EIEIO譜圖相似性網(wǎng)絡(luò)要優(yōu)于CID（Figure 2）。

Figure 2. ?Spectral similarity networks for EIEIO (a) and CID (b) modes. (c) The partially enlarged drawing of (a). (d) The partially enlarged detail of (b). (e) Compounds appearing simultaneously in both subnetworks.

結(jié)構(gòu)相似性網(wǎng)絡(luò)的評估

為對非靶向代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行深度注釋，我們開發(fā)了一種結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的分子網(wǎng)絡(luò)策略（SGMNS)。為了評估SGMNS對EIEIO非靶向代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的有效性，作者選取構(gòu)建了一個結(jié)構(gòu)相似性網(wǎng)絡(luò)（17651個節(jié)點和1128.23萬條邊)，Sim1（結(jié)構(gòu)相關(guān)性）閾值為0.4，包括上萬個從數(shù)據(jù)庫中篩選出的代謝物。

結(jié)果表明，在EIEIO模式下，結(jié)構(gòu)相似性網(wǎng)絡(luò)的注釋覆蓋率和準(zhǔn)確率均高于CID模式。這是因為某些結(jié)構(gòu)相似的代謝物在CID模式下表現(xiàn)出較低的MS/MS圖譜相似性，導(dǎo)致注釋無法通過結(jié)構(gòu)相似性網(wǎng)絡(luò)傳播。此外，某些結(jié)構(gòu)相似的代謝物在CID模式下表現(xiàn)出較高的MS/MS圖譜相似性，導(dǎo)致通過結(jié)構(gòu)相似性網(wǎng)絡(luò)傳播注釋的錯誤。

該研究利用血漿樣品（NIST SRM 1950)評估了結(jié)構(gòu)相似性網(wǎng)絡(luò)對EIEIO非靶代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的注釋性能，并與CID模式下的注釋性能進(jìn)行了比較。研究人員基于十種已知代謝物，利用結(jié)構(gòu)相似性網(wǎng)絡(luò)分別從LC-CID-HRMS/MS和LC-EIEIO-HRMS/MS數(shù)據(jù)中成功注釋了1049和2337個代謝物特征（圖3b)。此外，共有858個代謝物特征同時被兩種解離模式注釋，其中94.87%（814/858)的代謝物特征有相同的候選代謝物。結(jié)果顯示，CID和EIEIO模式的注釋結(jié)果可以相互補(bǔ)充和驗證。

Figure3.?(a) Annotation coverage and accuracy of CID and EIEIO modes for the spiked plasma sample by the structural similarity network. (b) The annotation results of CID and EIEIO modes from NIST SRM 1950 by the structural similarity network.

前列腺癌癥樣本的分析

研究收集了來自24名健康對照組（HC)和27名前列腺癌（PCa）患者的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，以EIEIO/CID非靶向代謝組學(xué)分析為例進(jìn)行分析。在CID和EIEIO模式下，分別成功獲得了7073和6876個獨特代謝物特征的MS/MS圖譜。生成的主成分分析（PCA)得分圖顯示HC組和PCa組之間存在明顯的差異（圖4a)。通過非參數(shù)檢驗（nonparametric test）發(fā)現(xiàn)，HC組和PCa組之間共有812個代謝物特征存在明顯差異（P＜0.05)（圖4c)，其中87個代謝物是通過EIEIO或CID-非靶向代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的結(jié)構(gòu)相似性網(wǎng)絡(luò)注釋。對這87個差異顯著的代謝物進(jìn)行通路分析，結(jié)果顯示多個代謝通路（鞘脂代謝、甘油磷脂代謝和亞油酸代謝)受到了不同程度的擾動（圖4d)，這與之前的結(jié)果基本一致。

Figure 4. ?(a) PCA score plot for QC, HC, and PCa groups. (b) The annotation results of QC samples in CID and EIEIO modes. (c) Volcano plot of the metabolite features from HC and PCa samples. (d) Pathway analysis of the 87 significantly differential metabolites. (e) Relative intensities of SM(41:1) and Plasmenylcholine in HC and PCa groups. (f) ROC curve of biomarkers for the diagnosis of PCa.

總結(jié)

該研究利用EIEIO和MN的協(xié)同優(yōu)勢，為大規(guī)模代謝組學(xué)注釋提出了一種新方法。結(jié)果表明，EIEIO圖譜中豐富的片段離子能使圖譜和結(jié)構(gòu)相似性之間的相關(guān)性更強(qiáng)。這提高了MN對非靶向代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的注釋性能。結(jié)構(gòu)相似性網(wǎng)絡(luò)作為一種獨立于譜圖庫的大規(guī)模注釋方法，有效地解決了由于EIEIO譜圖數(shù)據(jù)庫缺乏而導(dǎo)致的EIEIO非靶向代謝組學(xué)注釋的難題。這種方法只需要約10個已知代謝物就可注釋數(shù)千個代謝物，這為大規(guī)模代謝組學(xué)注釋提供了另一種解決方案。

SCIEX ZenoTOF 7600?

液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)及EAD技術(shù)簡介：

SCIEX ZenoTOF 7600由SCIEX在2022年推出，不但包含傳統(tǒng)的CID碎裂模式，還包含EAD碎裂模式。EAD碎裂模式和CID碎裂模式因其碎裂原理不同，其兩者碎片表現(xiàn)出強(qiáng)互補(bǔ)性，為結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確鑒定提供了進(jìn)一步完善的解決方案。

ZenoTOF? 7600及EAD圖片來源：SCIEX中國官方網(wǎng)站

7600的EAD碎裂模式，因最大的應(yīng)用特點就是：EAD的電子動能（KE，Electron Kenetic Energy），EAD參數(shù)）可調(diào)，保證了EAD技術(shù)可以在一臺儀器上實現(xiàn)ECD（Electron Capture Dissociation）、Hot ECD（Hot Electron Capture Dissociation）和EIEIO三種裂解，從而使其能真正做到大分子和小分子應(yīng)用的全兼容。EAD因其碎裂模式的獨特性被廣泛應(yīng)用到肽段同分異構(gòu)體、蛋白翻譯后修飾、二硫鍵位點鑒定和小分子結(jié)構(gòu)鑒定等定性、定量領(lǐng)域，為科學(xué)的進(jìn)步發(fā)揮了獨特作用。

文章大量參考并引用了油料脂質(zhì)分析實驗室推出的微信推文（文獻(xiàn)分享：分子網(wǎng)絡(luò)-電子碰撞激發(fā)技術(shù)增強(qiáng)代謝物注釋 (qq.com)），在此表示感謝。

文章信息：Wang, X., Sun, X., Wang, F., Wei, C., Zheng, F., Zhang, X., Zhao, X., Zhao, C., Lu, X., & Xu, G. (2024). Enhancing Metabolome Annotation by Electron Impact Excitation of Ions from Organics-Molecular Networking. Analytical chemistry, 96(4), 1444–1453. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c03443.

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