【解讀】qPCR平臺期對結(jié)果的影響

TIANGEN

2024.2.22

你可能在qPCR實驗時有過疑問：

qPCR實驗復(fù)孔為什么在平臺期曲線高度不一樣呢？對結(jié)果會有影響嗎？

想要知道原因，先要了解為什么會有平臺期。qPCR的擴增原理與大家熟知的普通PCR（Polymerase Chain Reaction）相同，隨著擴增的進行，原料底物消耗或多次循環(huán)后聚合酶失活，擴增產(chǎn)物產(chǎn)量趨于穩(wěn)定。那么如果原料底物等足量或者過量，酶活十分穩(wěn)定，PCR是否還會有平臺期呢？答案是肯定的，為什么依舊會存在平臺期呢？

PCR擴增同樣是一個酶促反應(yīng)，符合酶促動力學(xué)原理。擴增中期產(chǎn)物量呈指數(shù)增長并逐漸積累，當(dāng)引物-模板-酶達到一定比例時，酶促反應(yīng)趨于飽和，產(chǎn)物不再增加，就會出現(xiàn)所謂的平臺期。

前期研究表明，相同的樣本開展多次重復(fù)實驗，在平臺期的重復(fù)性及穩(wěn)定性差于指數(shù)期，不適用進行定量計算，因此qPCR結(jié)果基于指數(shù)期的數(shù)據(jù)計算。所以即使小伙伴發(fā)現(xiàn)qPCR實驗復(fù)孔平臺期不一致，但只要復(fù)孔間的△CT值小于0.5，并不會影響實驗結(jié)果。? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

以玉米基因 NK603 構(gòu)建的質(zhì)粒為模板，在 TGreat Real 96 上使用 FP217 對同一樣本開展 96 次重復(fù)定量實驗。實驗結(jié)果表明指數(shù)期的重復(fù)性及穩(wěn)定性優(yōu)于平臺期。

當(dāng)然有細(xì)心的小伙伴還會有疑問，使用不同廠家qPCR試劑，擴增相同基因也使用相同qPCR定量儀器進行定量分析，最后平臺期的熒光強度為什么有區(qū)別？其實平臺期熒光強度受多個因素的影響，包括產(chǎn)物量、試劑組分（如SYBR Green含量）等。

同一試劑微調(diào)組分后，擴增同一目的片段并使用 ABI QuantStudio 3進行qPCR上機分析，平臺期熒光強度產(chǎn)生了較為顯著的差異。

大家在挑選定量試劑時，應(yīng)重點關(guān)注試劑的擴增效率、穩(wěn)定性和特異性，TIANGEN定量明星試劑FastReal 快速熒光定量PCR預(yù)混試劑 (SYBR Green)（目錄號：FP217），使用優(yōu)化的PCR Buffer體系, 不僅試劑穩(wěn)定性好，同時保證試劑的高擴增效率和產(chǎn)物的特異性。

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