抗體偶聯(lián)ADC分析與表征

基泰生物

2023.11.29

抗體偶聯(lián)藥物（ADC）分析與表征

抗體偶聯(lián)藥物(ADC)是一類新興的生物治療藥物，由抗體、連接子和小分子細胞毒素三部分組成。與傳統(tǒng)抗體藥物相比，結(jié)構(gòu)會更加復(fù)雜，其復(fù)雜程度受抗體種類、偶聯(lián)方式、連接子與毒素種類等多個因素影響。因此ADC分析方法的建立具有特殊性，分析方法很難做到完全平臺化，需要根據(jù)每類ADC的自身質(zhì)量屬性的特點進行差異化開發(fā)。隨著越來越多復(fù)雜形式ADC分子的出現(xiàn)，如何合理且準確地看到ADC特有的各類質(zhì)量屬性將是未來的難點和挑戰(zhàn)。本文就ADC分析與表征的基礎(chǔ)技術(shù)做簡要介紹探討。

ADC產(chǎn)品關(guān)鍵質(zhì)量屬性（Critical Quality Attributes, CQA）舉例如下圖所示。根據(jù)先驗知識和平臺經(jīng)驗，與分子安全性和有效性相關(guān)的物理、化學(xué)、生物或微生物性質(zhì)及特征，均可納入關(guān)鍵質(zhì)量屬性，且需隨產(chǎn)品開發(fā)階段的進步而不斷加深研究。ADC主要的關(guān)鍵質(zhì)量屬性包括一級結(jié)構(gòu)、高級結(jié)構(gòu)、純度與雜質(zhì)、載藥量與藥物分布（Drug-to-Antibody Ratio, DAR）、含量、效價以及其他必須的生物制品質(zhì)量屬性。

本文將從載藥量與藥物分布、游離藥物、分子大小變異體和電荷變異體四個方面進行介紹，討論各類分析技術(shù)是如何靈活配合用于表征分析ADC質(zhì)量屬性。

DAR及其分布?

DAR（Drug-to-Antibody Ratio），即藥物小分子與抗體分子的數(shù)量比例，可指示平均每個抗體上偶聯(lián)上的小分子藥物個數(shù)。DAR與ADC的療效和安全性直接相關(guān)，低載藥量（低DAR）會降低ADC的效力，而高載藥量（高DAR）會改變ADC分子的藥代動力學(xué)和毒性。常規(guī)用于定量DAR的方法有光譜（UV-Vis）、色譜（HPLC）和質(zhì)譜（LCMS）等。如下圖所示，已上市ADC產(chǎn)品在DAR分析質(zhì)控上主要是光譜和色譜這兩類技術(shù)。

1. 光譜方法（UV-vis）

可實現(xiàn)DAR監(jiān)控需要有如下三個前提條件：

1）有效載荷應(yīng)含有紫外可見發(fā)色團；

2）有效載荷和抗體在其紫外可見光譜中應(yīng)顯示出不同的吸收峰屬性；?

3）連接子-有效載荷的存在不影響ADC樣品中抗體部分的光吸收性質(zhì)。

?根據(jù)抗體部分和載荷部分的不同吸光度和消光系數(shù)，依據(jù)Beer-Lambert原理計算出DAR值及ADC濃度

2. 色譜方法（HPLC）

常見的可用于DAR分析的色譜方法有疏水色譜（HIC）和反相色譜（RP）。疏水色譜利用不同載藥組分的疏水性質(zhì)差異進行分離，不同的固定相（苯基、丁基、醚基等）具有不同的疏水性和選擇特性，采用高鹽濃度流動相使蛋白結(jié)合到固定相，繼而降低鹽濃度進行洗脫，這種溫和的結(jié)合與洗脫條件可以保持ADC藥物的天然構(gòu)象。HIC是可在完整分子水平上監(jiān)控DAR的最佳方法，可直接定量不載藥抗體（DAR0）組分，一般認為D0為非有效組分且會占據(jù)ADC結(jié)合位點影響ADC內(nèi)吞。

反相色譜（RP）利用目標分子之間的極性差異進行分離，分離度較好，且方法本身質(zhì)譜兼容，可直接進行不同載藥形式的分子量定性。反相方法也可直觀看到小分子藥物在不同位點的分布情況。如下圖所示，對于常規(guī)鏈間二硫鍵巰基偶聯(lián)的ADC分子，由于高載藥異質(zhì)性，需對樣品進行還原后再進行分析，目標物非完整狀態(tài)，雖然可以監(jiān)控藥物在不同位點的分布，但無法定量完整的不載藥抗體DAR0的比例。

3. 質(zhì)譜方法（LC-MS）

?質(zhì)譜方法是另一種常用的DAR分析技術(shù)。目前使用電噴霧電離(ESI)與飛行時間(TOF)或具有更大質(zhì)量范圍的Orbitrap可以以足夠的分辨率區(qū)分ADC的異質(zhì)分子物種。例如，在還原和非還原條件下，通過完整的質(zhì)量測量，可以獲得ADC分子的完整質(zhì)量分布。

以上三種常規(guī)分析技術(shù)擁有各自的優(yōu)點和最佳應(yīng)用場景，可按照ADC分子特點和所處的開發(fā)階段，按需開發(fā)或配置相應(yīng)的DAR定量方法。

游離藥物?

所有ADC共有的一個重要質(zhì)量屬性是游離(未結(jié)合)藥物的數(shù)量，這會引起對毒性和潛在安全問題的關(guān)注。未偶聯(lián)藥物或藥物相關(guān)雜質(zhì)的殘留量可能殘留在最終產(chǎn)品中。未偶聯(lián)藥物的相關(guān)形式，如連接藥物種類或其他降解產(chǎn)物，也可以在偶聯(lián)物存儲期間釋放。因此，開發(fā)和應(yīng)用合適的方法來檢測、表征和量化游離藥物是至關(guān)重要的。常規(guī)的游離藥物監(jiān)控方法的開發(fā)思路如下。

分子大小變異體?

分子大小變異體(聚集體、片段等)是重要的質(zhì)量屬性，可直接影響蛋白質(zhì)療法的療效或安全性。聚集是蛋白質(zhì)最常見的物理降解途徑，且ADC比抗體更容易聚集，主要是因為藥物/連接子分子的存在，使連接位點的局部表面具有更多的疏水性。與抗體分析的技術(shù)一致，體積排阻色譜（SEC）、光散射（SEC-MALS）等常規(guī)技術(shù)可用于支持ADC分子聚合體的分析表征，非還原/還原毛細管電泳（non-reduced/reduced Capillary Electrophoresis）可用于支持ADC片段的分析表征。

電荷變異體

與抗體一致，ADC的電荷變異體是關(guān)鍵的質(zhì)量屬性，因為它們對穩(wěn)定性和生物活性有潛在影響。在ADC中可以觀察到各種形式的與電荷相關(guān)的異質(zhì)性，貢獻這些異質(zhì)性的因素包括抗體自身展示的電荷變異性、偶聯(lián)工藝過程引入的修飾、小分子藥物本身的結(jié)構(gòu)以及在不同偶聯(lián)位點引起的電荷變化等。常規(guī)分析技術(shù)如離子交換色譜（Ion Exchange Chromatography，IEX）或者等點聚焦電泳（iCIEF）可以實現(xiàn)電荷變異體的監(jiān)測。常規(guī)的電荷變異體表征策略也適用于ADC分子，富集單一變異體組分后，進行完整水平（Top-down）、亞基水平（Middle-down）或肽段水平（bottom-up）質(zhì)譜解析。