科研干貨 | 一文讀懂TEAA如何在核酸分離中大顯身手

賽默飛生命科學(xué)

2023.9.14

前言：目前已有幾種基于寡核苷酸的療法獲得了美國(guó)食品及藥物管理局（FDA）的批準(zhǔn)，但由于寡核苷酸的合成和降解途徑復(fù)雜，涉及復(fù)雜的化學(xué)修飾，會(huì)產(chǎn)生數(shù)以百計(jì)的雜質(zhì)，因此，使核酸的分離具有挑戰(zhàn)性。而所有治療用寡核苷酸在進(jìn)入人體前都必須經(jīng)過化學(xué)修飾，其中一種修飾是硫代磷酸酯（PS）修飾，這種修飾會(huì)產(chǎn)生非對(duì)映異構(gòu)體：對(duì)于 20 核苷酸長(zhǎng)的 PS 寡核苷酸，非對(duì)映異構(gòu)體超過 50 萬個(gè)。[1]?本文，我們介紹三乙胺乙酸如何助力治療用寡核苷酸分析，尤其是在核酸定量分析和表征檢測(cè)中如何發(fā)揮作用。

TEAA是什么？

三乙胺乙酸（ Triethylamine Acetate，TEAA ）是一種離子對(duì)試劑，本身是疏水性，同時(shí)又帶正電荷，一方面，TEAA 的疏水基團(tuán)又與固定相上碳 -18 鏈的疏水基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，另一方面，TEAA與核酸主鏈上的磷酸基團(tuán)的負(fù)電荷反應(yīng)。

而實(shí)現(xiàn)核酸分離是根據(jù)其堿基數(shù)目、構(gòu)象、疏水性等特性，如，核酸中的磷酸基團(tuán)帶負(fù)電，RNA分子呈親水性。像TEAA這種離子對(duì)試劑，起著連接核酸和柱基質(zhì)之間的橋梁作用，使核酸吸附在固定相上面，然后，通過改變流動(dòng)相中乙腈的濃度實(shí)現(xiàn)核酸的分離。換而言之，TEAA通過在核酸與柱基質(zhì)的相互作用，從而分離核酸。

TEAA的應(yīng)用場(chǎng)景

TEAA用于mRNA的HPLC的純度和定量分析

在Europe PMC上報(bào)道了一項(xiàng)研究，用TEAA配制HPLC的緩沖液，純化后，降低了mRNA的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生的mRNA不會(huì)誘導(dǎo)IFN和炎性細(xì)胞因子，并且，在原代細(xì)胞中的翻譯水平提高了10 ~ 1,000倍。[2] 其中，緩沖液配制方法如下：?

緩沖液 A 含 0.1 M 三乙胺乙酸 (TEAA)，pH = 7.0；

緩沖液 B 含 0.1 M 三乙胺乙酸，pH = 7.0 和 25% 乙腈。

可見，用TEAA配制的HPLC的緩沖液，降低了免疫反應(yīng)，提高了mRNA的翻譯效率，加速了mRNA從體外干細(xì)胞生成到體內(nèi)基因治療的研究進(jìn)展。

TEAA用于mRNA Mapping 的LC-MS分析

在2022年Analytical Chemistry報(bào)道了一項(xiàng)研究，通過開發(fā)了一種自動(dòng)化、高通量的工作流程，用于快速表征大RNA 和 mRNA 治療藥物并直接繪制序列圖。其中，mRNA mapping分析中，將RNase T1消化后直接溶解在TEAA中。[3] 隨后，使用TEAA配制的緩沖液，進(jìn)行質(zhì)譜分析：

緩沖液 A 由 pH 值為 7.0 的 100 mM 三乙胺乙酸（TEAA）組成；

緩沖液?B 由 pH 值為 7.0 的 0.1 M TEAA 組成，其中含有 25% 的乙腈

使用TEAA配制的緩沖液，在mRNA Mapping 的LC-MS分析后，獲得了＞80% 的序列覆蓋率的大 RNA 和 mRNA 治療藥物，在90分鐘內(nèi)即可完成，大大縮短了分析時(shí)間。

TEAA用于mRNA加帽加尾的LC/MS分析

在2022年Europe PMC上報(bào)道了一項(xiàng)研究，目的是開發(fā)一種流動(dòng)相混合物，可以通過質(zhì)譜法減少寡核苷酸的電荷態(tài)和加合物形成的數(shù)量，并使用這種流動(dòng)相混合物來檢測(cè)mRNA的加帽效率和polyA尾長(zhǎng)。通過在流動(dòng)相A中使用30mMHFIP, 10mm TEAA和1.2 mM TEA和乙醇的混合物，分析polyA尾長(zhǎng)和加帽效率，而不需要在消化后進(jìn)行額外的樣品制備。[5]通過使用含有TEAA的流動(dòng)相，無需在質(zhì)譜分析前對(duì)樣品進(jìn)行脫鹽處理，大大減少了樣品制備時(shí)間和分析所需的 RNA 量。[4]

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近年來，?隨著越來越多的文獻(xiàn)報(bào)道，TEAA憑借其獨(dú)特的離子對(duì)性質(zhì)，不僅可用于核酸HPLC的純度和定量分析，而且在核酸的LC/MS分析上也發(fā)揮重要作用，相信未來，TEAA在核酸分離上會(huì)有越來越多的應(yīng)用被科研工作者發(fā)現(xiàn)。

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參考文獻(xiàn)：

[1]?Torgny Fornstedt, Martin Enmark,Separation of therapeutic oligonucleotides using ion-pair reversed-phase chromatography based on fundamental separation science,Journal of Chromatography Open,Volume 3,2023,100079,ISSN 2772-3917,

https://doi.org/10.1016/j.jcoa.2023.100079.

(https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2772391723000038)

[2]?Karikó K, Muramatsu H, Ludwig J, Weissman D. Generating the optimal mRNA for therapy: HPLC purification eliminates immune activation and improves translation of nucleoside-modified, protein-encoding mRNA. Nucleic Acids Research. 2011 Nov;39(21):e142. DOI: 10.1093/nar/gkr695. PMID: 21890902; PMCID: PMC3241667.

[3] Vanhinsbergh CJ, Criscuolo A, Sutton JN, Murphy K, Williamson AJK, Cook K, Dickman MJ. Characterization and Sequence Mapping of Large RNA and mRNA Therapeutics Using Mass Spectrometry. Anal Chem. 2022 May 24;94(20):7339-7349. doi: 10.1021/acs.analchem.2c00765. Epub 2022 May 12. PMID: 35549087; PMCID: PMC9134182.

[4]?Strezsak SR, Pimentel AJ, Hill IT, Beuning PJ, Skizim NJ. Novel Mobile Phase to Control Charge States and Metal Adducts in the LC/MS for mRNA Characterization Assays. ACS Omega. 2022 Jul;7(26):22181-22191. DOI: 10.1021/acsomega.2c00185. PMID: 35811888; PMCID: PMC9260895.

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