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干貨滿滿！流式檢測CAR T細(xì)胞PK的方法學(xué)驗證
目前全球已有9款CAR T細(xì)胞治療產(chǎn)品上市用于治療B細(xì)胞腫瘤。不同于傳統(tǒng)藥物，CAR T在靜脈注射給藥后會分布到各個器官包括腫瘤組織，循環(huán)濃度在短時間內(nèi)下降，隨后CAR與腫瘤靶點(diǎn)結(jié)合，CAR T細(xì)胞被激活并增殖，循環(huán)CAR T細(xì)胞往往在給藥2周達(dá)到峰值，之后根據(jù)個體差異呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢，有的個體會長期監(jiān)測到一定水平的CAR T細(xì)胞，并且與長期緩解有關(guān)。因此監(jiān)測CAR T細(xì)胞在外周血循環(huán)藥代動力學(xué)（Pharmacokinetics，PK）對于臨床預(yù)后的判斷至關(guān)重要。
目前實(shí)驗室常用的方法有ddPCR, qPCR以及流式細(xì)胞術(shù)（FCM）等，ddPCR和qPCR均是在轉(zhuǎn)基因水平監(jiān)測CAR的拷貝數(shù)，而在醫(yī)院等實(shí)驗室很難獲得廠家的scfv序列，因此很難進(jìn)行監(jiān)測。而FCM是目前實(shí)驗室最常用的檢測手段之一，不管是科研單位還是醫(yī)院流式細(xì)胞儀都是必需的的檢測儀器，因此利用FCM方法來監(jiān)測CAR T細(xì)胞的PK是最簡便且快速的方法，且同時可以進(jìn)行免疫分型以及T細(xì)胞功能的檢測。
這篇文章中，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院的科學(xué)家以CD19 CAR為例，驗證商業(yè)化抗體Rabbit anti-mouse FMC63單抗R19M 檢測CAR19 T細(xì)胞的特異性、最低檢測限LOD、最低定量限LLOQ以及精密度，同時通過大量臨床樣品驗證了FCM和ddPCR方法學(xué)的相關(guān)性和一致性（準(zhǔn)確度），具體信息已在表1和圖1中詳細(xì)闡明。
CAR T細(xì)胞藥代動力學(xué)的一般規(guī)律：FDA推薦推薦CAR T細(xì)胞相關(guān)PK參數(shù)包括：達(dá)峰濃度（C max）；達(dá)峰時間（T max）；部分藥時曲線下面積（pAUC）；最后觀測濃度（C last）；C last時間以及半衰期（t 1/2）；
表1. 驗證設(shè)計方案以及數(shù)據(jù)統(tǒng)計評估
圖1. 整體驗證方案的工作流程圖
01
特異性
本研究中，對比了三種CAR檢測抗體protein L、CD19抗原蛋白以及抗CAR抗體R19M在外周血樣本中的特異性，通過圖2結(jié)果表明protein L的特異性較抗原蛋白和R19M抗體差，而重組抗原蛋白存在不穩(wěn)定性，因此本研究選擇特異性和穩(wěn)定性較好的R19M進(jìn)行CAR T藥代動力學(xué)的檢測。
圖2. Agilent NovoCyte流式細(xì)胞儀進(jìn)行圈門策略以及抗體特異性驗證
02
靈敏度
流式方法分析的靈敏度包括最低檢測限LOD也就是指信號值與背景值得區(qū)分能力，本研究中根據(jù) 15 份不含 CAR19 T 細(xì)胞的 外周血樣本的 FCM 檢測結(jié)果計算出 LOD（即平均值加三倍 SD 值）。最終檢測出平均值為0.016%，而SD為0.00696%，因此LOD最終為0.03678%（圖2B）。
基于LOD值，利用wild-type 293FT細(xì)胞梯度稀釋陽性對照細(xì)胞293FT-CAR19，將CAR陽性比例的最低理論值設(shè)置在0.05%。根據(jù)圖3結(jié)果，7個稀釋梯度的檢測值與理論值線性相關(guān)R2=0.9999。且在最低稀釋比例組中，9個樣品的平均檢測值為0.048%，intra-CV為10.8%，inter-CV為2.0%。結(jié)果表明，當(dāng)采集足夠多的細(xì)胞時，通過R19M 抗體流式檢測 CAR19 陽性細(xì)胞的的 LLOQ 設(shè)為 0.05% 是安全的。
圖3.Agilent NovoCyte流式細(xì)胞儀進(jìn)行梯度稀釋293FT-CAR19細(xì)胞的線性檢測結(jié)果
03
準(zhǔn)確度
本研究中通過ddPCR的方法來驗證準(zhǔn)確度，并在兩種來源的陽性樣品（293FT-CAR19細(xì)胞系和188份CAR19 T細(xì)胞治療后的臨床外周血樣本）上進(jìn)行了FCM和ddPCR的并排檢測。根據(jù)檢測結(jié)果分析CAR T/Lym 和 copies/μg DNA的相關(guān)性，在陽性細(xì)胞系上的結(jié)果表明二者的斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)為1（圖4A），呈完全相關(guān)。而在臨床樣本數(shù)據(jù)中，188個樣本的相關(guān)系數(shù)為0.6875呈強(qiáng)相關(guān)。
研究者發(fā)現(xiàn)在CAR T/Lym<0.5%的樣品中，F(xiàn)CM和ddPCR數(shù)據(jù)呈弱相關(guān)（r=0.3577）。當(dāng)只分析CAR T/Lym>=0.5%的樣品，發(fā)現(xiàn)相關(guān)系數(shù)增加到了0.814，呈極強(qiáng)相關(guān)性。這些數(shù)據(jù)共同表明在臨床檢測中，ddPCR 和 FCM 在監(jiān)測 CAR19 T 細(xì)胞藥代動力學(xué)方面具有相對較好的一致性，同步證明了FCM作為臨床上CAR T細(xì)胞PK檢測方法的準(zhǔn)確性。
圖4. FCM和ddPCR檢測結(jié)果的相關(guān)性研究結(jié)果
04
精密度
使用 CAR19 陽性的 293FT 細(xì)胞系通過梯度稀釋制備了標(biāo)準(zhǔn)樣本。每個樣本在三個獨(dú)立實(shí)驗中進(jìn)行處理和檢測，每個實(shí)驗有三個重復(fù)，并測定FCM和ddPCR兩種方法的 inter-CV和 intra-CV值。結(jié)果顯示所有結(jié)果中CV均不超過18%，表明兩種方法都能精確定量CAR19陽性細(xì)胞。然而發(fā)現(xiàn)兩種方法的CV在CAR19豐度下降時均會升高，表明兩種方法在定量低表達(dá)豐度的CAR19時精密度都會下降。
圖5. FCM和ddPCR的精密度對比研究結(jié)果
05總結(jié)
應(yīng)用 FCM 是檢測和定量體內(nèi)CAR19 T 細(xì)胞的一種可靠的方法，它與 ddPCR 具有良好的一致性。在檢測 CAR T 細(xì)胞豐度較低的樣本時，ddPCR 和 FCM 的精確度都有所下降，導(dǎo)致兩種技術(shù)的一致性降低。因此，同時采用ddPCR 和 FCM 兩種方法檢測 CAR T 細(xì)胞可為體內(nèi) CAR T 細(xì)胞動力學(xué)提供更可靠的結(jié)果。
而本研究中FCM采用的是安捷倫Novocyte系列智能化流式細(xì)胞儀，Novocyte系列流式細(xì)胞儀配備頂級的核心硬件，保證儀器的性能與靈敏度?？商峁┒噙_(dá) 5 個激光器和最多 30 個獨(dú)立檢測器，多達(dá) 30 個熒光通道的靈活選擇。軟件設(shè)置中英文界面，并做到采集與分析為一體，同時內(nèi)置多種數(shù)據(jù)分析模塊。搭配自動化上樣系統(tǒng)NovoSampler Q，可集成到不同的實(shí)驗室自動化平臺中，滿足流式管、不同規(guī)格EP管以及多種微孔板等，能夠?qū)崿F(xiàn)無人值守自動化采集功能。Novocyte系列流式細(xì)胞儀一直以來以其卓越的性能、高靈敏度以及操作簡便而深受客戶的喜愛。
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