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利用高內(nèi)涵篩選分析系統(tǒng)進(jìn)行心肌細(xì)胞增殖分析
* 文章來源于 Bio-protocal
摘要：
哺乳動物出生后心臟生長的方式由心肌細(xì)胞增殖逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樾募〖?xì)胞肥大，成年心臟受損后心肌細(xì)胞增殖不足以彌補(bǔ)丟失的心肌細(xì)胞，所以探究心肌細(xì)胞增殖機(jī)制對于受損心肌補(bǔ)充新的心肌細(xì)胞至關(guān)重要。磷酸化組蛋白 H3 (pH3) 在細(xì)胞有絲分裂過程中高表達(dá)，作為一種核分裂標(biāo)志物，是檢測心肌細(xì)胞增殖的常用指標(biāo)。高內(nèi)涵篩選分析技術(shù)是一種能夠進(jìn)行熒光顯微成像和定量圖像分析的自動化高通量篩選技術(shù)，能夠?qū)⑺脤?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行量化，更加清楚明了展現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在這里，我們使用高內(nèi)涵篩選分析系統(tǒng)分析 pH3+?陽性心肌細(xì)胞數(shù)量，以評估心肌細(xì)胞增殖的程度。
?
材料與試劑
?
1 天、30 天齡 C57BL/6J 小鼠（維通利華）
濕盒
組化筆（abcam, catalog number: ab2601）
蓋玻片（世泰，catalog number: 10212450C）
粘附載玻片（世泰，catalog number: 188105）
組織包埋盒（世泰，catalog number: 31050102w）
PBS 緩沖液粉末 pH7.3（中杉金橋，catalog number: ZLI-9062）
PBS 緩沖液 pH7.4（gibco, catalog number: C10010500BT）
4% 多聚甲醛（LEAGENE, catalog number: DF0135）
50X EDTA 抗原修復(fù)液（LEAGENE, catalog number: YB-23522-1）
DEPC 水（LEAGENE, catalog number: NR0001）
Tween 20（Biofroxx, catalog number: 1247ML500）
山羊血清封閉液（中杉金橋，catalog number: ZLI-9056）
Trito x-100 破膜液（Sigma-Aldrich, catalog number: X100）
抗體稀釋液（中杉金橋，catalog number: ZLI-9030）
pH3 抗體（Millipore，種屬反應(yīng)性：小鼠，人，catalog number: 06-570）
α-actinin 抗體（Abcam，種屬反應(yīng)性：小鼠，大鼠，人， catalog number: ab9465）
Alexa Fluor 488 羊抗兔免疫熒光抗體（Invitrogen, catalog number: A21206）
?Alexa Fluor 594 羊抗鼠免疫熒光抗體（Invitrogen, catalog number: A21203）
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儀器設(shè)備
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全自動組織脫水機(jī)（Leica, catalog number: ASP300S）
包埋機(jī)（Leica, catalog number: EG1150H）
石蠟切片機(jī)（Leica, catalog number: RM2235）
展片機(jī)（Leica, catalog number: HI1210）
烤片機(jī)（Leica, catalog number: HI1220）
全自動染色機(jī)、封片機(jī)（Thermo Fisher Scientific, catalog number: ClearVue+ Gemini）
超純水設(shè)備（Thermo Fisher Scientific, catalog number: 50136146）
電磁攪拌器（IKA, catalog number: MS100）
脫色搖床（海門麒麟醫(yī)用儀器廠，catalog number: TS-2）
渦旋振蕩器（Scientific Industries, catalog number: SI-0256）
臺式高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf, catalog number: 5804R）
移液器（Eppendorf）
普通 4 °C 冰箱
共聚焦顯微鏡（Zeiss, catalog number: LSM 800）
高內(nèi)涵篩選分析系統(tǒng)（Molecular Devices, catalog number: ImageXpress Micro）
?軟件?
ZEN
MetaXpress
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實(shí)驗(yàn)步驟
?一
石蠟切片的制備
1
1 天、30 天齡的 C57BL/6J 小鼠購買自北京維通利華公司；
2
1 天齡小鼠置于冰上麻醉 2 min，30 天齡小鼠按照 0.2ml/20g 注射濃度為 17.5 μg/ml 的三溴乙醇溶液進(jìn)行麻醉。剪刀剪開小鼠胸腔部分皮膚和皮下組織肌肉層，鑷子撐開胸腔，迅速剪下心臟和流出道置于預(yù)冷的 PBS 緩沖液中，剪掉血管連帶的多余組織，排出心臟中的血液；
3
4% 多聚甲醛中固定心臟組織。1 天齡小鼠心臟組織固定 24 h，30 天齡小鼠心臟組織固定 48 h。固定結(jié)束后將心臟組織置于包埋盒中在流動水下沖水，去除心臟組織中的多聚甲醛液體；
4
依據(jù)心臟組織大小使用全自動脫水機(jī)的不同程序進(jìn)行脫水，樣本依次置于 75%、85%、95% 和無水乙醇中，隨后在二甲苯中透明，最后置于 60 °C 液態(tài)石蠟浸泡；
5
使用石蠟包埋機(jī)將心臟組織按照胸腔中心臟位置擺放，利用石蠟將心臟組織固定于包埋盒中；
6
蠟塊置于冰凍機(jī)冷凍 1 小時，展片機(jī)預(yù)熱溫度至 45 °C，使用 Leica 石蠟切片機(jī)切至心臟最大面，使得心臟腔室完全暴露（圖 1），隨后按照 5 μm 厚度進(jìn)行切割，使得組織切片完全粘附于載玻片，待用。
二
免疫熒光染色
1
組織粘附的載玻片置于烤片機(jī)上 68 °C 烘烤 45 min ，防止脫片；
2
載玻片依次放入二甲苯 Ⅰ、Ⅱ 中各 10 min ，乙醇濃度為 100%、95%、80%、75%、50% 中水化 5 min ，蒸餾水洗 5 min ；
3
提前配制 1× EDTA 抗原修復(fù)液（pH=9.0）于高壓鍋內(nèi)煮沸，將心臟組織切片放入高壓鍋中，使得修復(fù)液完全覆蓋組織切片，高溫修復(fù) 2 min ，流動水下沖洗冷卻 20 min ；
4
PBST 緩沖液沖洗 5 min ，2 次；PBS 緩沖液沖洗 5 min ，3 次；
5
配制 0.3% 封閉通透液滴加在心臟組織切片上，室溫孵育 1 h ；
6
抗體稀釋液稀釋 pH3 一抗與 α-actinin 一抗滴加到切片組織表面，4 °C 過夜；
7
一抗孵育 16 h 后，室溫復(fù)溫 1 h ；
8
PBST 緩沖液沖洗 5 min ，2 次；PBS 緩沖液沖洗 5 min ，3 次；
9
按照 1:400 比例使用 PBS 稀釋 Alexa Fluor 594 羊抗小鼠、Alexa Fluor 488 羊抗兔免疫熒光二抗，適量滴加于心臟組織切片上，室溫避光孵育 1h；
10
PBST 緩沖液沖洗 5min ，2 次；PBS 緩沖液沖洗 5min ，3 次；
11
含 DAPI 的封片劑進(jìn)行封片，注意封片時不能有氣泡產(chǎn)生。
三
熒光共聚焦顯微鏡成像
使用熒光共聚焦顯微鏡進(jìn)行成像（圖 2）。
四
高內(nèi)涵篩選分析系統(tǒng)圖像采集
采用 High Content Image Processing Software 進(jìn)行圖像采集（圖 3），流程如下：
1
使用無水乙醇將玻片擦拭干凈，晾干后置于高內(nèi)涵篩選分析系統(tǒng)中進(jìn)行圖像采集與分析；
2
打開 MetaXpress 5.1 軟件，選擇 10 倍物鏡，根據(jù)采集對象選擇單個玻片采集；
3
每個心臟組織框選 18 × 18 個視野，我們選擇 DAPI、FITC、Texas Red 三個熒光通道，選取一個視野調(diào)整熒光通道參數(shù)；
4
動態(tài)拍照狀態(tài)下選擇采集區(qū)域；
5
采集圖像。
五
高內(nèi)涵篩選分析系統(tǒng)數(shù)據(jù)分析
選擇采集的圖像熒光信號（圖 3），選擇一個視野分別對三個熒光通道進(jìn)行參數(shù)調(diào)整， 首先調(diào)整“All nuclei”熒光強(qiáng)度圈選出 DAPI 標(biāo)記的細(xì)胞核，其次根據(jù)“GFP”熒光強(qiáng)度圈出 pH3+ 表達(dá)位點(diǎn)，最后根據(jù)“Texas Red”圈出 α-actinin 標(biāo)記的心肌細(xì)胞（圖 4）， 統(tǒng)計(jì)細(xì)胞核中表達(dá) pH3 的心肌細(xì)胞數(shù)量即為增殖的心肌細(xì)胞數(shù)量（圖 5）。
?
結(jié)果與分析
?1
HE 染色展示石蠟切片機(jī)切至心臟最大面，心臟四腔室完全暴露（圖 1）。
圖 1.HE 染色展示心臟石蠟切片最大面
2
使用共聚焦熒光顯微鏡對心臟組織切片進(jìn)行成像，Z 軸掃描顯示 pH3 與心肌細(xì)胞細(xì)胞核共定位（圖 2）。
圖 2.熒光共聚焦顯微鏡成像
哺乳動物出生后 1 周心肌細(xì)胞退出細(xì)胞周期（Alkass et al.,2015），因此，在小鼠出生后 1 天心肌細(xì)胞增殖旺盛，pH3+?細(xì)胞數(shù)量較多；而小鼠出生 30 天心肌細(xì)胞幾乎不再增殖，pH3+?心肌細(xì)胞無法被檢測到。
3
高內(nèi)涵篩選分析系統(tǒng)分別采集心臟組織切片中 DAPI、FITC、Texas Red 熒光標(biāo)記的圖像流程及采集的熒光信號。按照圖 3A 所示流程依次設(shè)置圖像采集區(qū)域，分別將 DAPI 標(biāo)記的細(xì)胞核、pH3 標(biāo)記的增殖點(diǎn)、α-actinin 標(biāo)記的心肌細(xì)胞熒光信號調(diào)至清晰焦面。
圖 3. 高內(nèi)涵篩選分析系統(tǒng)圖像采集流程及采集熒光圖像。A.圖像采集流程界面；B.DAPI 標(biāo)記的細(xì)胞核；C.pH3 標(biāo)記的增殖細(xì)胞；D. α-actinin 標(biāo)記的心肌細(xì)胞；E. 三通道疊加。
4
分析采集圖像的熒光信號。
在圖 4 中，選擇一個圖像視野，分別圈出 DAPI 標(biāo)記細(xì)胞核、pH3 標(biāo)記細(xì)胞增殖點(diǎn)、α-actinin 標(biāo)記心肌細(xì)胞的熒光信號。如上圖所示，A（左）為分析 DAPI 標(biāo)記熒光信號的參數(shù)設(shè)置，A（中）為 DAPI 標(biāo)記熒光信號的采集圖像，A（右）為分析 DAPI 標(biāo)記熒光信號的圈選區(qū)域；B（左）為分析 pH3 標(biāo)記熒光信號的參數(shù)設(shè)置，B（中）為 pH3 標(biāo)記熒光信號的采集圖像，B（右）為分析 pH3 標(biāo)記熒光信號的圈選區(qū)域；C（左）為分析 α-actinin 標(biāo)記熒光信號的參數(shù)設(shè)置，C（中）為 α-actinin 標(biāo)記熒光信號的采集圖像，C（右）為分析 α-actinin 標(biāo)記熒光信號的圈選區(qū)域。
圖 4. 熒光信號圖像數(shù)據(jù)分析設(shè)置。DAPI 熒光信號數(shù)據(jù)分析；B. pH3 熒光信號數(shù)據(jù)分析；C. α-actinin 熒光信號數(shù)據(jù)分析。
5
所采集圖像的熒光信號分析結(jié)束后，系統(tǒng)自動計(jì)算 pH3+ 心肌細(xì)胞數(shù)量所占比例， 格式如下：
采集圖像的熒光信號分析結(jié)束后，根據(jù) DAPI、FITC、Texas ?Red 三通道定位情況，計(jì)算細(xì)胞核中表達(dá) pH3 的心肌細(xì)胞數(shù)量，得出如圖 5 所示的結(jié)果?！癝ubtotal Profile 1XX”表示 DAPI 染細(xì)胞核的數(shù)量為 1156 ，“Subtotal Profile 12X”表示 DAPI 與 pH3 共定位的細(xì)胞數(shù)為 18 ，“Subtotal Profile 1X3”表示細(xì)胞核完整的心肌細(xì)胞數(shù)量為 103 ，“Subtotal Profile 123”表示細(xì)胞核表達(dá) pH3 的心肌細(xì)胞數(shù)為 9 ，則增殖的心肌細(xì)胞比例為表達(dá) pH3 的心肌細(xì)胞數(shù)量與所有的心肌細(xì)胞數(shù)量之比。
圖 5. 高內(nèi)涵篩選分析系統(tǒng)分析數(shù)據(jù)結(jié)果格式
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溶液配方
?1
1× EDTA 抗原修復(fù)液
將 50× 的 EDTA 抗原修復(fù)液 20 ml 加入到 980 ml 超純水中配制為 1× EDTA 抗原修復(fù)液待用；
2
0.3% 封閉通透液
將 3 μl Trito x-100 破膜液加入到 1 ml 山羊血清封閉液中配制為 0.3% 封閉通透液；
3
PBST 緩沖液
將 23 g PBS 粉末加入到 2 L 超純水中，攪拌至粉末全部溶解，液體澄清，為 PBS 緩沖液；將 2 ml Tween-20 加入到 PBS 緩沖液中，攪拌至澄清，為 PBST 緩沖液。
致謝
感謝中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院心血管疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室高精光學(xué)技術(shù)平臺老師的大力支持。感謝國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（NO. 81770308）基金資助。該實(shí)驗(yàn)方案已在 Li et al. (2020)、Wang et al. (2020) 等人發(fā)表文章中使用。
參考文獻(xiàn)
1.Alkass, K., Panula, J., Westman, M., Wu, T.D., Guerquin-Kern, J.L. and Bergmann, O. (2015). No Evidence for Cardiomyocyte Number Expansion in Preadolescent Mice. Cell 163: 1026-1036.
2.Li, Y., Feng, J., Song, S., Li, H., Yang, H., Zhou, B., Li, Y., Yue, Z., Lian, H., Liu, L., Hu, S. and Nie, Y. (2020). gp130 Controls cardiomyocyte proliferation and heart regeneration. Circulation 142(10): 967-982.
3.Wang, Y., Li, Y., Feng, J., Liu, W., Li, Y., Liu, J., Yin, Q., Lian, H., Liu, L. and Nie, Y. (2020). Mydgf promotes Cardiomyocyte proliferation and Neonatal Heart regeneration. Theranostics 10(20): 9100-9112.
關(guān)于美谷分子儀器
Molecular Devices 始創(chuàng)于上世紀(jì) 80 年代美國硅谷，并在全球設(shè)有多個代表處和子公司。2005 年，Molecular Devices 在上海設(shè)立了中國代表處，2010 年加入全球科學(xué)與技術(shù)的創(chuàng)新者丹納赫集團(tuán)，2011 年正式成立商務(wù)公司：美谷分子儀器 (上海) 有限公司。Molecular Devices 以持續(xù)創(chuàng)新、快速高效、高性能的產(chǎn)品及完善的售后服務(wù)著稱業(yè)內(nèi)，我們一直致力于為客戶提供在生命科學(xué)研究、制藥及生物治療開發(fā)等領(lǐng)域蛋白和細(xì)胞生物學(xué)的創(chuàng)新性生物分析解決方案。
