大分子藥物生物分析中的主要應(yīng)用技術(shù)
生物大分子藥物目前主要包括治療性蛋白藥物與核酸藥物等,隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展,生物大分子已被普遍用以治療腫瘤、本身免疫系統(tǒng)疾病和遺傳代謝病等多種疾病。生物治療藥物在臨床和商業(yè)上的成功引起了行業(yè)內(nèi)對(duì)其開發(fā)的日益重視,需要高質(zhì)量的生物分析來支持這些藥物的開發(fā)。
與常規(guī)藥物一樣,評(píng)估大分子藥物的安全性和有效性需要徹底了解其藥代動(dòng)力學(xué)(PK)、藥效學(xué)(PD)、毒代動(dòng)力學(xué)(TK)以及免疫原性等特征。在藥物與機(jī)體相互作用中,PK是研究機(jī)體對(duì)藥物的處置作用,而PD和TK是分別研究藥物對(duì)機(jī)體有益/有害的效應(yīng)。PD/PK和PK/TK的相互關(guān)系是藥物藥理學(xué)評(píng)價(jià)的核心。FDA、NMPA等監(jiān)管機(jī)構(gòu)要求藥物進(jìn)入臨床前必須證明其有效性和安全性,臨床前和臨床研究均需要研究藥物的PK,同時(shí)FDA建議對(duì)免疫原性風(fēng)險(xiǎn)檢測(cè)最好在IND階段和臨床I期開展。因此,建立好的PD/PK/TK等生物分析方案對(duì)于大分子藥物的臨床前及臨床分析評(píng)價(jià)極為重要。
與小分子藥物相比,大分子藥物具有分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、細(xì)胞外基質(zhì)不容易透過、使用量低、身體易溶解等特性,其生物分析充滿挑戰(zhàn)。
生物大分子藥物與傳統(tǒng)小分子藥物的藥代動(dòng)力學(xué)
特征比較(藥學(xué)進(jìn)展?,2018年8期?)
傳統(tǒng)的生物分析方法通常依賴于基于小分子檢測(cè)的液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)和基于生物制劑的配體結(jié)合分析(ligand-binding assay,LBA)),目前這兩種方法也用于抗體等生物藥的生物分析中。在現(xiàn)在的創(chuàng)新藥物中,還有mRNA、病毒載體、細(xì)胞治療產(chǎn)品等,這些藥物本質(zhì)上并非蛋白質(zhì)藥物,因此qPCR、流式細(xì)胞術(shù)、成像技術(shù)等手段也越來越多地用于生物藥的生物分析中。
01
基于配體結(jié)合分析
生物分析中基于配體結(jié)合分析LBA是一種常用的分析工具,用于根據(jù)與其他生物分子的相互結(jié)合作用(binding interaction),定量測(cè)定生物分子(目標(biāo)分析物,Analyte)在生物體液中的濃度,主要包括酶聯(lián)免疫(ELISA)等。
目前ELISA是生物制藥行業(yè)使用最廣泛的配體結(jié)合式(LBA)檢測(cè)平臺(tái),它一直以來都是蛋白質(zhì)定量分析最常用的技術(shù),現(xiàn)在大多數(shù)生物標(biāo)志物的商業(yè)檢測(cè)試劑盒都是基于ELISA的。這項(xiàng)技術(shù)對(duì)于某些臨床前生物分析的應(yīng)用仍然很有吸引力,比如血清單克隆抗體的PK。但是ELISA操作復(fù)雜、測(cè)試運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng),采用自動(dòng)化平臺(tái)可縮短分析人員操作的時(shí)間, 提高工作效率。
丹納赫生命科學(xué)旗下貝克曼庫(kù)爾特的Biomek i7自動(dòng)化工作站結(jié)合美谷分子儀器的SpectraMax i3 多功能酶標(biāo)儀,可以自動(dòng)化地對(duì)樣本進(jìn)行高通量的ELISA操作,大大避免實(shí)驗(yàn)誤差及重復(fù)的人工勞動(dòng)。
自動(dòng)化工作站進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)流程
自動(dòng)化工作站進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果
02
液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)LC-MS/MS
與LBA 相比,LC-MS/MS 在生物分析中的優(yōu)勢(shì)在于可以提供快速的方法開發(fā)和驗(yàn)證、高特異性和高重現(xiàn)性,還可以實(shí)現(xiàn)多種分析物同時(shí)定量。另外,LC-MS/MS 方法也更容易在不同的分析物類別和基質(zhì)之間轉(zhuǎn)移。但是靈敏度、樣品制備、方法開發(fā)和定量準(zhǔn)確度相關(guān)的難題也亟需解決。
丹納赫生命科學(xué)旗下SCIEX開發(fā)了一種通用的混合LBA和LC-MS/MS兩種技術(shù)的工作流程,該工作流程結(jié)合了這兩種技術(shù)的優(yōu)勢(shì),可用于蛋白質(zhì)藥物的PK分析。該方法檢測(cè)阿達(dá)木單抗在小鼠血漿中的濃度,先用磁珠方法進(jìn)行免疫親和性樣品的制備,然后將阿巴利單抗標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行消化后進(jìn)入TripleTOF? MS系統(tǒng)進(jìn)行肽圖譜分析,用以選擇蛋白質(zhì)定量的特征性肽段。在QTRAP 6500+系統(tǒng)進(jìn)行定量分析后,50 到 10000 ng/mL 的線性關(guān)系可達(dá)0.99763,定量限為50 ng/mL。
LC-MS/MS方法的前處理流程
阿達(dá)木單抗的提取離子色譜圖? ?
SCIEX QTRAP? 6500+ 系統(tǒng)
03
qPCR技術(shù)
qPCR法是常用的分析核酸藥物表達(dá)量的一種方法,其定量下限可以達(dá)到pg/mL甚至fg/mL,這可以極大增強(qiáng)藥物在體內(nèi)暴露的檢測(cè)時(shí)間。此外,RT-qPCR使用的樣本量極少,只需要幾微升血漿樣本或1毫克組織即可滿足分析需求,減少了對(duì)珍貴樣本的使用,而且能夠使用384孔板實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本的高通量分析。然而獲得信號(hào)特異、低背景的qPCR結(jié)果也非易事,丹納赫生命科學(xué)旗下IDT埃德特的雙淬滅熒光探針,在靠近報(bào)告基團(tuán)9bp左右的位置增加一個(gè)中間淬滅基團(tuán),為FRET作用中提供了一個(gè)能量的“中轉(zhuǎn)站”,拉近了能量傳遞中每個(gè)基團(tuán)間的距離,從而提高了熒光淬滅率降低了背景信號(hào)。
IDT 雙淬滅熒光探針示意圖
(藍(lán)色序列片段即為雙淬滅熒光探針)
在過去20年中,新型治療方式的出現(xiàn)改變了生物分析領(lǐng)域的現(xiàn)狀,導(dǎo)致了一系列技術(shù)的發(fā)展和成熟。在發(fā)現(xiàn)階段以及藥物開發(fā)的臨床前和臨床階段,健全的生物分析方法非常重要,這將有助于開發(fā)更安全、更有效的藥物,同時(shí)減少開發(fā)的時(shí)間和成本。丹納赫生命科學(xué)一系列先進(jìn)的生物分析工具和方法能夠有效幫助應(yīng)對(duì)創(chuàng)新藥物復(fù)雜結(jié)構(gòu)和不同作用機(jī)制對(duì)PK、PD和免疫原性評(píng)估提出的重大挑戰(zhàn)。
更多產(chǎn)品信息咨詢,
-
微信文章
-
微信文章微信文章微信文章微信文章微信文章微信文章微信文章微信文章微信文章微信文章微信文章微信文章微信文章微信文章微信文章微信文章微信文章微信文章微信文章