揭秘科研“瑕疵”：如何解決質(zhì)譜成像中的批次效應(yīng)？

鹿明生物

2023.5.05

質(zhì)譜成像是一種用于分析生物分子分布的成像技術(shù)，它通過在組織切片上掃描激光并收集質(zhì)譜數(shù)據(jù)來獲取組織中生物分子的空間分布信息。雖然許多初始技術(shù)挑戰(zhàn)現(xiàn)已得到解決，但所謂的批次效應(yīng)已經(jīng)顯著地阻礙了從特定中型研究中獲得可靠數(shù)據(jù)比較。

本次的干貨將主要解決以下問題：

在質(zhì)譜成像數(shù)據(jù)中批次效應(yīng)可能在哪些層次（像素、切片、玻片、時間和位置）？可能對生物標志物發(fā)現(xiàn)或多元分類的影響？后續(xù)會有更多干貨內(nèi)容，記得關(guān)注收藏哦~

如何解決質(zhì)譜成像中的批次效應(yīng)？

在質(zhì)譜成像技術(shù)進行實驗時，常常會出現(xiàn)批次效應(yīng)，這會導(dǎo)致實驗結(jié)果的誤差和不可重復(fù)性，從而影響研究結(jié)論的可靠性和準確性。圖1展示了質(zhì)譜成像中批次效應(yīng)的類型和影響。

圖中a顯示了技術(shù)變異可以掩蓋給定生物效應(yīng)大小的情況，這可以單獨出現(xiàn)（綠色矩形）或在累積批次效應(yīng)（紅色三角形）的情況下發(fā)生。

圖b展示了批次效應(yīng)的不同類型和影響，包括信號強度偏移、信號峰的位置偏移、峰形狀和寬度的變化等。

圖 1：質(zhì)譜成像中的批次效應(yīng)

批次效應(yīng)可以在像素（pixel）、切片（section）、載玻片（slide）、時間（time）和位置（location）等不同層次上表現(xiàn)出來。

質(zhì)譜成像在不同層次上的批次效應(yīng)

1、質(zhì)譜成像在像素層次上的批次效應(yīng)

在質(zhì)譜成像中，數(shù)據(jù)集是從組織切片的不同位置獲取的質(zhì)譜集合。圖 2 展示了在像素、區(qū)域、切片和玻璃片級別上的批次效應(yīng)。

圖2：質(zhì)譜成像在像素、切片和玻璃片級別上的批次效應(yīng)

在 (a) 中，基質(zhì) (左) 或每個像素固有的化學(xué)成分 (右) 導(dǎo)致的離子抑制可以導(dǎo)致組織中信號強度的人工差異，從而導(dǎo)致像素和區(qū)域相關(guān)的批次效應(yīng)。?

(b) 組織區(qū)域的不同化學(xué)組成也會影響組織上消化速度，從而導(dǎo)致區(qū)域相關(guān)的批次效應(yīng)。

?(c) 區(qū)域相關(guān)的批次效應(yīng)也可能是由于MS運行期間系統(tǒng)性的技術(shù)變異而引起的。

?(d) 在由71個連續(xù)組織切片組成的數(shù)據(jù)集中觀察到了在切片、玻璃片和日期級別上的批次效應(yīng)。

2.數(shù)據(jù)準備質(zhì)譜成像在切片層次上的批次效應(yīng)

和一個像素在一個區(qū)域中的位置類似，不同位置的切片也可能因測量本身的批次效應(yīng)而暴露不同（圖2d）。

圖3展示了組織切片級別的批次效應(yīng)可能對多變量像素分類的影響。圖(a)顯示了32個癌癥組織的像素級分類，其中紅色和黑色代表兩種不同的臨床特征。圖(b)中不同的顏色表示每個交叉驗證階段留出用于測試的數(shù)據(jù)。

結(jié)果顯示，在十倍交叉驗證中，分類器的準確率顯著更高（圖c）。然而，這種情況在臨床實踐中是不現(xiàn)實的，因為新的質(zhì)譜成像數(shù)據(jù)對分類器來說是未知的。

圖3：組織切片層次的批次效應(yīng)對多變量像素分類的影響

3.質(zhì)譜成像在載玻片層次上的批次效應(yīng)

玻璃載玻片可以被視為一個批次，因為該載玻片上的所有像素，無論它們屬于一個或多個組織切片，都經(jīng)歷了相同的樣品制備和質(zhì)譜分析過程（圖2d）。當分析組織微陣列（TMA）時，這種情況可能會變得明顯。

圖4這張圖展示了在組織微陣列(TMA)中可能存在的批次效應(yīng)。由于不同類別之間在TMA之間可能分布不均，因此在生物標記物的發(fā)現(xiàn)中可能會出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

圖4：TMA中可能出現(xiàn)的批次效應(yīng)

批次效應(yīng)的消除方法

在質(zhì)譜成像實驗中避免、識別和糾正批次效應(yīng)的方法中，研究設(shè)計是最有效的手段之一，可以通過隨機化、技術(shù)重復(fù)和阻斷來減少技術(shù)偏差。

在像素級別，異常值檢測、數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和魯棒數(shù)據(jù)統(tǒng)計是處理批次效應(yīng)的有效方法。在質(zhì)譜成像數(shù)據(jù)中，可以使用單變量匯總統(tǒng)計量（如均值、標準差、中位數(shù)、四分位數(shù)）來識別潛在的異常值。然而，考慮到質(zhì)譜成像數(shù)據(jù)的多變量特性，使用主成分分析（PCA）來識別異常值可能更為可取，例如通過在二維或三維的PCA空間中使用誤差橢圓（如圖5b，左）。對于3D數(shù)據(jù)，回歸分析可以用來識別離群的切片，這些切片通常與3D堆疊中的趨勢偏離（如圖5b，右）。

圖5展示了通過實驗設(shè)計和異常值檢測來緩解批次效應(yīng)的方法。首先，通過阻擋法（Blocking）來消除質(zhì)譜成像研究中已知的干擾因素（如玻片）。為了檢測玻片的異常值（b左），可以利用從質(zhì)量控制中獲得的分子譜的主成分分析（紅色點在綠色95％誤差橢圓之外）。在三維（3D）質(zhì)譜成像中，可以使用回歸分析來檢測不符合預(yù)期信號強度梯度的異常切片（b右）。

圖5：實驗設(shè)計和異常值檢測來緩解批次效應(yīng)

批次效應(yīng)的挑戰(zhàn)

為了得到足夠數(shù)量的生物學(xué)重復(fù)樣本用于臨床研究，可以將不同中心的研究結(jié)果結(jié)合起來，以提高發(fā)現(xiàn)真正生物學(xué)差異的機會。然而，由于實驗設(shè)置的多參數(shù)性質(zhì)，標準化方法的開發(fā)仍然具有挑戰(zhàn)性。以下幾個解決方案：

(1) 實驗工作流的優(yōu)化和標準化；

(2) 質(zhì)量控制的建立；

(3) 在不同層面上進行歸一化以減少批次效應(yīng)的影響。

圖6展示了通過樣品間歸一化來調(diào)整批次效應(yīng)的方法。為確保多個樣品集之間的可比性，可以使用各種方法來估計縮放因子。

圖6：通過樣品間歸一化來調(diào)整批次效應(yīng)

總結(jié)

現(xiàn)在，質(zhì)譜成像必須致力于研究，以指導(dǎo)下一代儀器、軟件和實驗工作流程的開發(fā)和驗證，以更好地理解、避免緩解質(zhì)譜成像中發(fā)生在不同層面的批次效應(yīng)。專門致力于質(zhì)量保證和標準化的

質(zhì)譜成像科學(xué)社區(qū)聯(lián)盟，如MALDISTAR?或METASPACE?。

以上就是這期的干活內(nèi)容了，您有任何問題，都可以掃描下方微信，聯(lián)系我們哦~