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mRNA LNP“旋凍干”技術(shù)，脂質(zhì)組分和緩沖液如何影響mRNA凍干制劑特性？
文章來源：RNAScript 公眾號(hào)
眾所周知，mRNA技術(shù)作為全新的疫苗技術(shù)手段，相對(duì)于傳統(tǒng)疫苗技術(shù)而言，具有安全、有效、生產(chǎn)工藝相對(duì)簡(jiǎn)單且無關(guān)序列、研發(fā)周期短等優(yōu)勢(shì)，然而，到目前為止，市面上的mRNA疫苗普遍需要在超低溫下儲(chǔ)存（輝瑞/BioNTech的BNT162b2需要在?80?°C ~?60?°C下儲(chǔ)運(yùn)；Moderna的mRNA-1273 需要在?20?°C儲(chǔ)運(yùn)），使得其儲(chǔ)存和分配運(yùn)輸相對(duì)于其他疫苗技術(shù)更復(fù)雜，成本更高，最終導(dǎo)致中低收入國(guó)家的可及性降低。
凍干技術(shù)在低溫真空下通過升華去除水分，可相對(duì)溫和地將脆弱的生物大分子或膠體納米顆粒制備成凍干制劑，已有研究顯示該技術(shù)可滿足mRNA-LNP在室溫下的長(zhǎng)期儲(chǔ)存需求，并能維持復(fù)溶后的轉(zhuǎn)染效力（瑞科吉生物早前就已發(fā)布全球首款凍干型mRNA疫苗的人體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，證實(shí)了凍干mRNA疫苗復(fù)溶后可維持轉(zhuǎn)染效力）。
近日，來自比利時(shí)根特大學(xué)藥學(xué)院的研究團(tuán)隊(duì)在Journal of Controlled Release上發(fā)表了題為“Continuous freeze-drying of messenger RNA lipid nanoparticles enables storage at higher temperatures（mRNA脂質(zhì)納米顆粒經(jīng)連續(xù)冷凍干燥可在較高溫度下儲(chǔ)存）”的文章。該文章應(yīng)用了一種名為“基于旋轉(zhuǎn)冷凍的連續(xù)凍干技術(shù)”（Continuous freeze-drying based on spin-freezing）的方式，使得冷凍與干燥得過程效率更高，并通過一系列設(shè)備實(shí)現(xiàn)了整個(gè)工藝流程的質(zhì)量監(jiān)控。在此基礎(chǔ)上，該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步篩選了不同緩沖液類型和脂質(zhì)配比，并評(píng)估這兩項(xiàng)工藝參數(shù)對(duì)凍干生產(chǎn)過程中制劑的理化特性（尺寸、電位、分散系數(shù)以及形態(tài)）、不同溫度下的存儲(chǔ)穩(wěn)定性，以及復(fù)溶后轉(zhuǎn)染效力的影響。
“旋凍干”工藝設(shè)備
目前主流的凍干工藝主要依靠傳統(tǒng)“分批”凍干法，其采用的設(shè)備特性決定了其凍干制劑通常需要不短的制備時(shí)間（~7天），限制了制劑的高效快速生產(chǎn)，同時(shí)也無法做到對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的精確控制。在傳統(tǒng)凍干設(shè)備中，需要將裝有水性制劑的小瓶平放于類似“烤盤”的板塊上，并依次將多個(gè)板塊置入分層式的熱控架中。在整個(gè)制備過程中，往往因?yàn)榉謱优c小瓶位置的不同，使得設(shè)備內(nèi)的水分升華受限，熱傳導(dǎo)不均勻。由此造成殘留水分與成核時(shí)間的不同，并導(dǎo)致了同批次產(chǎn)品質(zhì)量屬性不一致的問題。
與傳統(tǒng)凍干設(shè)備不同，本研究中所用的“旋凍干”技術(shù)，其選用的設(shè)備為“單瓶連續(xù)冷凍干燥系統(tǒng)”（The Single Vial Continuous Freeze-Drying System，SVU，RheaVita）。該系統(tǒng)可模擬連續(xù)生產(chǎn)線的加工條件，在短時(shí)間內(nèi)快速評(píng)估和篩選不同配方和工藝變量。
進(jìn)行冷凍干燥時(shí)，使用適配旋轉(zhuǎn)攪拌器的I型玻璃小瓶（2ml，德國(guó)米爾海姆肖特）填充400μl保護(hù)劑溶液和400μl含有12.5μg mRNA的mRNA-LNP懸浮液。將小瓶插入WB6000-D頂置攪拌器（Wiggens，北京，中國(guó)），這一設(shè)備避免了分層不同空間位置放置造成的成核時(shí)間不同與水分升華的效率。隨后在該設(shè)備中沿各制劑瓶的縱軸以4000rpm的速度旋轉(zhuǎn)，從而在小瓶?jī)?nèi)壁上鋪開薄的液體層，使制劑的升華表面積大幅增加，提高升華速度。然后將旋轉(zhuǎn)的小瓶同時(shí)暴露在壓縮空氣中，壓縮空氣使用液氮熱交換器冷卻至約-60°C的溫度。使用Bronkhorst F-202AV質(zhì)量流量控制器（Flowcor，Olen，比利時(shí)）控制氣體流量，并將其設(shè)置為18 l / min或80 l / min的恒定速率，分別提供慢速或快速冷凍速率。通過設(shè)備實(shí)現(xiàn)了各小瓶相同的工藝條件，這是傳統(tǒng)分批凍干所做不到的。研究還使用FLIR A655sc熱像儀（Thermal Focus, Ravels，比利時(shí)）測(cè)量每個(gè)制劑瓶溫度，將樣品瓶冷凍并冷卻至?50°C的最終溫度。與傳統(tǒng)分層“烤盤”式的制備工程相比，實(shí)現(xiàn)了對(duì)每個(gè)產(chǎn)品單位的質(zhì)量把控。
之后將小瓶半塞并在真空下使用熱傳導(dǎo)干燥。干燥后，將小瓶用氮?dú)饣靥钪链髿鈮海⒓由w回收。通過設(shè)備特性在同一設(shè)備中保證了整個(gè)制備過程中一致的工藝條件，并也實(shí)現(xiàn)了同一設(shè)備中“連續(xù)“冷凍、干燥的制備流程。
圖1：“旋凍干”設(shè)備SVU的原理示意
脂質(zhì)比例與緩沖劑品類對(duì)凍干后特性的影響
本研究中主要評(píng)估的變量為可電離脂質(zhì)與 mRNA 的比例（wt比）以及緩沖劑品類和相應(yīng)劑量。該團(tuán)隊(duì)將等體積的mRNA LNP和保護(hù)劑（25 m/V%蔗糖或海藻糖（Merck）溶解在pH 7.4的Tris-，磷酸鹽或PBS緩沖液中）混合以產(chǎn)生終濃度為15.6μg/ ml mRNA和12.5 m/V%凍干保護(hù)劑的LNP懸浮液。LNP使用了可電離脂質(zhì)C12-200，輔助脂質(zhì)DSPC，膽固醇和DMG-PEG 2000的組分構(gòu)成，并采用了50：10：38.5：1.5 mol%的摩爾比。
圖2：凍干過程與實(shí)驗(yàn)設(shè)置圖解
為初步研究評(píng)估LNP中脂質(zhì)含量在多大程度上有助于冷凍干燥過程中mRNA LNP制劑的穩(wěn)定性，研究分別設(shè)置了C12-200:mRNA wt比為10：1和20：1兩組。同時(shí)，對(duì)市售mRNA疫苗制劑中使用的緩沖液（pH值為7.4的PBS、Tris及磷酸鹽）補(bǔ)充12.5 m/V%蔗糖作為凍干保護(hù)劑，分別在高和低緩沖液容量下進(jìn)行了評(píng)估。經(jīng)過凍干復(fù)溶后，研究者測(cè)量了粒徑大?。ㄆ骄担?、PdI（聚合物分散性指數(shù)）、zeta電位和 mRNA 包封效率來評(píng)估凍干mRNA-LNP的特性。
結(jié)果表明，對(duì)于所有制劑，凍干后粒徑和PdI沒有明顯增加（圖3A和B）。然而，研究觀察到在以C12-200：mRNA wt比為10：1配制的mRNA-LNP凍干后，包封率和包封在LNP中的mRNA數(shù)量急劇下降。這在PBS中透析的mRNA-LNP最為明顯，包封率從85%降低到僅58%（圖3C）。此外，mRNA LNP的zeta電位明顯下降（圖3E）。然而，在C12-200：mRNA wt比為20：1時(shí)，凍干mRNA LNP的包封率僅在使用PBS時(shí)降低（92%降至72%），而分散在磷酸鹽和Tris緩沖液中的mRNA LNP的性質(zhì)在凍干時(shí)沒有改變（圖3D&F）。
需要注意，不同緩沖液容量評(píng)估結(jié)果顯示，增加緩沖液容量不能明確防止包封的mRNA泄漏和zeta電位的下降。
圖3：不同wt比mRNA-LNP在不同容量緩沖液中凍干前后的特征
研究者接下來比較了HEK293T細(xì)胞中凍干制劑與非凍干制劑的轉(zhuǎn)染效率（圖2G&H）。在Tris和磷酸鹽緩沖液中，無論緩沖液容量如何，mRNA LNP都能在高C12-200：mRNA wt比下保持其轉(zhuǎn)染效率。mRNA LNP分散在PBS中時(shí)正如mRNA包封率下降那樣，轉(zhuǎn)染效率也急劇下降（±30%）。在低C12-200：mRNA比值下，我們觀察到凍干mRNA LNP在兩種容量的PBS下轉(zhuǎn)染效率均顯著降低，而在高容量和低容量的磷酸鹽和Tris緩沖液下的轉(zhuǎn)染效率只是略微降低。
當(dāng)C12-200：mRNA wt比從10增加到20，PBS被Tris或磷酸鹽緩沖液取代時(shí)，C12-200 mRNA LNP可以在含有12.5 m/V%蔗糖的配方中更好地完成凍干。
此外，研究還評(píng)估了其他工藝條件變化是否可以改善懸浮在Tris 12 mM中的C200-10：mRNA wt比為20：1的LNP凍干的結(jié)果。為此，研究者調(diào)整了冷凍速率（慢速和快速）和凍干保護(hù)劑（12.5m/V%蔗糖和海藻糖）。可以觀察到，快速冷凍相比慢速，其升華速率更勝一籌。另一方面，盡管將海藻糖用作凍干保護(hù)劑可以略微改善冷凍干燥過程，但無法完全防止凍干對(duì)轉(zhuǎn)染效率、包封效率和zeta電位的負(fù)面影響（圖4）。
圖4：評(píng)估凍干保護(hù)劑和冷凍速率優(yōu)化的影響
?mRNA LNP 凍干前后的形態(tài)變化
該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步研究了mRNA LNP在凍干前后的形態(tài)變化，使用了冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）以鑒定冷凍干燥前后mRNA LNP的形態(tài)（圖5）。
冷凍電鏡揭示了透析緩沖液和冷凍干燥過的程都會(huì)影響mRNA LNP的形態(tài)。在Tris中透析的mRNA LNP由固體無定形核心組成，一些懸浮在Tris中的LNP在凍干時(shí)形成囊泡，很可能源自于物理應(yīng)力誘導(dǎo)的分離。PBS透析導(dǎo)致mRNA LNP表現(xiàn)出異質(zhì)形態(tài)，形成內(nèi)含有mRNA或空的水性囊泡。同時(shí)，懸浮在PBS中的mRNA LNP凍干后產(chǎn)生了多層結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)在水性LNP中大多不存在，可能會(huì)引起相關(guān)安全性的考量。
圖5：冷凍電鏡下mRNA LNP在不同緩沖劑中的形態(tài)
?Tris 緩沖液可增強(qiáng)mRNA LNP凍干制劑在較高溫度下的穩(wěn)定性
盡管優(yōu)化后的mRNA LNPs在4°C下可穩(wěn)定保存12周，但這仍然需要冷鏈物流。出于這個(gè)原因，該團(tuán)隊(duì)還研究了凍干mRNA LNP是否可以提高在室溫（室溫，22°C）或更高溫度（37°C）下儲(chǔ)存的穩(wěn)定性。
對(duì)于在室溫（RT，22°C）下儲(chǔ)存的水性mRNA LNP，觀察到轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)量和MFI急劇減少（分別減少30%和40%）（圖5A和B）。相比之下，凍干制劑在22°C甚至37°C下儲(chǔ)存12周后不會(huì)失去轉(zhuǎn)染效率，表明凍干具有明顯的優(yōu)勢(shì)。
然而，我們注意到在37°C下儲(chǔ)存凍干的mRNA LNP時(shí)，粒徑從80納米增加到150納米（圖5E和F）。此外，我們還觀察到在22°C和37°C下儲(chǔ)存均會(huì)略微降低mRNA LNP在水和凍干條件下的包封率（圖5C&D）。然而，應(yīng)該注意的是，對(duì)于凍干和水性mRNA LNPs，包封率均穩(wěn)定維持了8周。
圖6：編碼eGFPs的mRNA LNP凍干制劑穩(wěn)定性
為驗(yàn)證小鼠肌內(nèi)注射給藥凍干mRNA LNP的轉(zhuǎn)染效率，研究者將C12-200：mRNA比值為20的編碼fLuc的mRNA LNP懸浮在含有12.5m/V%蔗糖的Tris 20mM中，隨后凍干并以3μgfLuc mRNA的劑量給予小鼠。作為陽(yáng)性對(duì)照，施用相同體積劑量的新鮮制備的fLuc mRNA LNP。注射后5小時(shí)，通過生物發(fā)光成像測(cè)量體內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)。fLuc mRNA LNPs凍干前后的體外轉(zhuǎn)染效率相似，并在小鼠模型中觀測(cè)到相似的mRNA表達(dá)效率，表明凍干可以應(yīng)用于包封各種類型mRNA的LNP（圖7）。
圖7：凍干mRNA LNP在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率
總結(jié)
研究提出了一種使用基于旋轉(zhuǎn)冷凍的連續(xù)冷凍干燥技術(shù)來凍干基于可電離脂質(zhì)類 C12-200 的 mRNA LNP 的方法。研究者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)可電離脂質(zhì)：mRNA wt比足夠高并且使用Tris或磷酸鹽而不是PBS作為緩沖液時(shí)，mRNA LNP的性質(zhì)在冷凍干燥后能保持不變。此外，fLuc mRNA LNP凍干制劑的熒光素酶表達(dá)在小鼠體內(nèi)沒有改變，證明了mRNA LNP凍干制劑可以增強(qiáng)mRNA疫苗在常溫下的穩(wěn)定性，在4°C、22°C甚至37°C下儲(chǔ)存12周時(shí)仍保留其功能，是一種有可行性的策略。
然而，我們也能注意到，在37°C下儲(chǔ)存的mRNA LNP凍干制劑，其粒徑表現(xiàn)出相當(dāng)大的變化（從80nm增加到150nm），同時(shí)異構(gòu)形態(tài)也帶來了對(duì)轉(zhuǎn)染有效性和安全性的疑慮。盡管在小鼠模型中依舊觀察到了穩(wěn)定維持的轉(zhuǎn)染效率，然而粒徑過大與異構(gòu)形態(tài)對(duì)于mRNA LNP在大型動(dòng)物及人類體內(nèi)的轉(zhuǎn)染依舊存在影響。我們之前在“LNP最新優(yōu)化方案，克服動(dòng)物模型研究局限性！”一文中探討了粒徑變化在不同物種中轉(zhuǎn)染效率的影響。有研究顯示，粒徑過大將導(dǎo)致mRNA LNP無法穿過NHP及人類肝窗并轉(zhuǎn)染肝臟細(xì)胞。因此該成果的臨床有效性與安全性仍需進(jìn)行進(jìn)一步的NHP模型驗(yàn)證，以復(fù)現(xiàn)較高溫儲(chǔ)存的凍干制劑與水性mRNA LNP相似的轉(zhuǎn)染效率和安全性。
另一個(gè)不可忽視的問題在于生產(chǎn)放大的可行性。該技術(shù)與傳統(tǒng)凍干工藝最大的不同在于對(duì)每個(gè)單位產(chǎn)品工藝的把控，雖然實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定的產(chǎn)品質(zhì)量控制與檢驗(yàn)，但不能忽視由此帶來的每批次產(chǎn)品產(chǎn)量產(chǎn)能的減少，設(shè)備的特性決定了“旋凍干”制備每批次產(chǎn)量無法與傳統(tǒng)工藝媲美。然而單位時(shí)間內(nèi)的整體產(chǎn)能我們并沒有在該文中得到相應(yīng)的對(duì)照，因此是否能將該工藝應(yīng)用到大規(guī)模生產(chǎn)中仍然存疑。
參考資料
Meulewaeter S, Nuytten G, Cheng MHY, De Smedt SC, Cullis PR, De Beer T, Lentacker I, Verbeke R. Continuous freeze-drying of messenger RNA lipid nanoparticles enables storage at higher temperatures. J Control Release. 2023 Mar 30;357:149-160. doi: 10.1016/j.jconrel.2023.03.039.
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