Nature | 菌群代謝物3-IAA有望大大提升胰腺癌化療療效！

麥特繪譜

2023.3.23

胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）因?yàn)槠涞母咿D(zhuǎn)移率和對(duì)治療的有限反應(yīng)，預(yù)計(jì)到2040年將成為第二大致命的癌癥。5-氟尿嘧啶（5-FU）、伊立替康和奧沙利鉑聯(lián)合亞葉酸（FOLFIRINOX），或吉西他濱聯(lián)合紫杉醇（GnP）的多重化學(xué)療法，是治療轉(zhuǎn)移性PDAC（mPDAC）患者的標(biāo)準(zhǔn)方法。然而，只有不到一半的患者對(duì)此類療法有效，沒有反應(yīng)的患者（NR）遭受治療的痛苦，并最終在幾周內(nèi)死亡。因此，迫切需要確定可能解釋有效（R）患者和NR患者之間差異的環(huán)境因素。目前還不確定菌群或飲食習(xí)慣是否以及如何影響其療效。來自德國漢堡-埃彭多夫醫(yī)學(xué)中心的Nicola Gagliani研究團(tuán)隊(duì)揭示菌群代謝物吲哚-3-乙酸（3-IAA）與治療效果之間存在顯著相關(guān)性，并提示化療聯(lián)合特定營養(yǎng)干預(yù)或能改善PDAC（甚至其他癌癥）療效，相關(guān)成果發(fā)表于Nature。

3-IAA誘導(dǎo)對(duì)化療療效的影響

招募30名mPDAC患者，其中23名未接受抗生素治療，在化療開始前收集其糞便樣本對(duì)腸道菌群進(jìn)行分析（圖1a）。根據(jù)放射學(xué)反應(yīng)；或根據(jù)無進(jìn)展生存期（PFS）和血清腫瘤標(biāo)志物的減少，將患者隊(duì)列分為治療有效的R組（n = 11）和治療無效的NR組（n = 12）。結(jié)果顯示，R組與NR組的腸道菌群呈現(xiàn)顯著差異（圖1b）。

為了研究菌群與化療反應(yīng)之間的潛在因果關(guān)系，將前10名招募的R和NR組的菌群轉(zhuǎn)移到無菌小鼠體內(nèi)，然后注射胰腺癌KPC細(xì)胞。其中，在兩組（R和NR）中，有四名患者接受了亞葉酸（FOLFIRINOX）治療，一名患者接受了吉西他濱和納布-紫杉醇（GnP）治療。結(jié)果顯示，無論最初的供體治療方法是哪一種，在化療治療后，與定植于NR組菌群的小鼠腫瘤相比，定植于R組菌群的小鼠腫瘤減?。▓D1c）。

鑒于腸道菌群有可能轉(zhuǎn)入PDAC腫瘤，進(jìn)行16S rRNA測(cè)序分析瘤內(nèi)菌群。結(jié)果顯示，12個(gè)腫瘤中只有2個(gè)檢測(cè)到瘤內(nèi)細(xì)菌，因此推測(cè)對(duì)化療的反應(yīng)是通過循環(huán)菌群衍生的代謝物而非細(xì)菌本身進(jìn)行調(diào)控的。收集R和NR組的患者血清以及相匹配的定植小鼠的血清，進(jìn)行靶向代謝組學(xué)檢測(cè)。結(jié)果顯示，與NR組相比，色氨酸代謝物3-IAA是R組中顯著增加最多的代謝物（圖1d）。與此一致的是，與NR組相比，3-IAA在定植于R的無菌小鼠血清中含量也顯著增加（圖1e）。為了確定R組的哪些腸道細(xì)菌可能有助于增加3-IAA的產(chǎn)生，分析R組的菌群中常見的產(chǎn)生3-IAA的細(xì)菌菌株的豐度。在分析的15個(gè)3-IAA生產(chǎn)者中，發(fā)現(xiàn)R組的脆弱擬桿菌和多形擬桿菌增加，并證實(shí)了它們?cè)隗w外產(chǎn)生 3-IAA 的能力。

那么是否可以通過調(diào)節(jié)3-IAA的前體色氨酸的飲食濃度來改變小鼠血清中的3-IAA水平，從而影響化療的療效呢？由于色氨酸會(huì)損害抗腫瘤免疫反應(yīng)的發(fā)展，從而促進(jìn)腫瘤的生長，首先確定不同時(shí)間長度的飲食干預(yù)的影響。結(jié)果顯示，四天的高色氨酸飲食干預(yù)可以避免促腫瘤生長的效果；且四天已經(jīng)足以增加被R菌群定植的無菌小鼠血清中3-IAA的濃度（圖1f）。此外，當(dāng)這種飲食干預(yù)與FIRINOX相結(jié)合時(shí)，觀察到腫瘤重量降低（圖1g）。此外，3-IAA血清水平與腫瘤重量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)（圖1g）；而在移植了NR患者菌群的小鼠身上，未出現(xiàn)上述現(xiàn)象。這提示，高色氨酸飲食的效果可能是由3-IAA介導(dǎo)的。

隨后，在無特定病原體（SPF）的小鼠中直接補(bǔ)充3-IAA后，發(fā)現(xiàn)其足以達(dá)到在用R菌群定植的小鼠中測(cè)得的濃度，且在SPF和在NR定植的無菌小鼠中均可提升化療療效（圖1h）。然而，在 R 組患者或 R 組小鼠中增加的另外兩種代謝物，即吲哚-3-丙酸（IPA）和馬尿酸，與 FIRINOX 聯(lián)合處理后均未發(fā)現(xiàn)與 3-IAA 相似的功效?？傊?，菌群衍生的色氨酸代謝物 3-IAA 在對(duì)化療有反應(yīng)的人和小鼠的血清中增加，且 3-IAA 的水平可以通過色氨酸的飲食干預(yù)來調(diào)節(jié)；3-IAA 甚至有效提升了化療耐藥的 PDAC 患者的化療療效。

?圖1?? 3-IAA誘導(dǎo)對(duì)化療療效的影響

3-IAA的作用由骨髓過氧化物酶所介導(dǎo)

菌群代謝物，特別是色氨酸代謝物，在塑造先天性和適應(yīng)性免疫方面具有關(guān)鍵作用，這反過來又在決定PDAC的化療效果和預(yù)后方面發(fā)揮重要作用。分別比較分析未接受化療以及接受R-或NR-菌群移植無菌小鼠中的腫瘤浸潤免疫細(xì)胞。結(jié)果顯示，與NR菌群移植小鼠相比，R菌群移植小鼠的CD8+T細(xì)胞的頻率增加，中性粒細(xì)胞減少。與未經(jīng)治療的小鼠相比，則未觀察到腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞的任何變化。當(dāng)被腸道菌群激活時(shí)，CD8+T細(xì)胞可以誘導(dǎo)PDAC的好轉(zhuǎn)。然而，通過抗體處理耗盡CD8+或同時(shí)耗盡CD4+和CD8+T細(xì)胞，并未降低接受標(biāo)準(zhǔn)或高色氨酸飲食的R-菌群移植小鼠的化療療效。同樣，CD4+和CD8+T細(xì)胞的耗竭并沒有降低3-IAA和FIRINOX對(duì)SPF小鼠的療效。因此，3-IAA的效果似乎并不取決于T細(xì)胞的存在。

中性粒細(xì)胞在PDAC中非常豐富，中性粒細(xì)胞減少與mPDAC的良好預(yù)后有關(guān)。3-IAA對(duì)具有高濃度骨髓過氧化物酶（MPO）的細(xì)胞具有特異性毒性，而MPO是中性粒細(xì)胞的標(biāo)志之一。從機(jī)制上講，MPO可以氧化3-IAA，誘發(fā)有毒產(chǎn)物，如3-亞甲基-2-羥吲哚（MOI）。與此一致，結(jié)果顯示，用3-IAA和FIRINOX培養(yǎng)骨髓來源的中性粒細(xì)胞，而非T細(xì)胞，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞存活率下降。此外，在骨髓來源的中性粒細(xì)胞培養(yǎng)物中加入MPO或使用內(nèi)源性MPO水平較高的未成熟中性粒細(xì)胞（前中性粒細(xì)胞）會(huì)增加3-IAA和FIRINOX的毒性。相比之下，IPA并沒有增加FIRINOX在體外誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞死亡的功效。進(jìn)一步表征中性粒細(xì)胞對(duì)3-IAA和FIRINOX反應(yīng)表明，該處理誘導(dǎo)了中性粒細(xì)胞脫顆粒和壞死，但沒有導(dǎo)致中性粒細(xì)胞胞外陷阱（NETs）的形成或凋亡。隨后在小鼠體內(nèi)驗(yàn)證該結(jié)果，發(fā)現(xiàn)3-IAA和FIRINOX的組合降低了SPF小鼠腫瘤和脾臟中中性粒細(xì)胞的頻率和數(shù)量，而單獨(dú)使用3-IAA治療卻并非如此（圖2a）。

鑒于中性粒細(xì)胞衍生的MPO在3-IAA釋放有毒產(chǎn)物中的關(guān)鍵作用，隨后探究這是否可以解釋3-IAA和FIRINOX治療腫瘤療效增加。從野生型或Mpo-/-小鼠中建立骨髓嵌合體。結(jié)果顯示，用FIRINOX和3-IAA治療會(huì)導(dǎo)致中性粒細(xì)胞的耗竭，并在野生型重組小鼠中顯示出協(xié)同效應(yīng)；而在用Mpo-/-骨髓重組的小鼠中，加入3-IAA并沒有導(dǎo)致腫瘤減小（圖2b），這表明MPO對(duì)3-IAA和FIRINOX的療效至關(guān)重要。還發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)使用FIRINOX相比，使用3-IAA和FIRINOX治療后，野生型SPF小鼠的腫瘤中3-IAA氧化產(chǎn)物MOI增加，進(jìn)一步支持MPO的作用。且在Mpo-/-骨髓重組小鼠的腫瘤中，MOI的水平強(qiáng)烈降低。

已報(bào)道芳烴受體（AhR）作為3-IAA和其他吲哚的細(xì)胞內(nèi)受體具有重要作用，探究了Ahr-/-骨髓重組小鼠是否對(duì)3-IAA和FIRINOX有抵抗力。結(jié)果表明，用3-IAA和FIRINOX治療后，Ahr-/-骨髓重組小鼠的腫瘤大小與野生型重組小鼠的腫瘤大小相同（圖2c）。這表明，3-IAA和FIRINOX的療效是由免疫細(xì)胞產(chǎn)生的MPO介導(dǎo)的，而非AhR信號(hào)介導(dǎo)。

?圖2?? 3-IAA的作用由骨髓過氧化物酶所介導(dǎo)

3-IAA的作用取決于ROS和自噬作用

3-IAA通過MPO的氧化在培養(yǎng)的中性粒細(xì)胞中誘導(dǎo)活性氧（ROS）的產(chǎn)生并且 ROS 是化療誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的主要介質(zhì)。因此，假設(shè)3-IAA和FIRINOX在有MPO的情況下的療效是由ROS介導(dǎo)的。分別用3-IAA、3-IAA和中性粒細(xì)胞、3-IAA和MPO與或不與化療一起培養(yǎng)小鼠和人類PDAC細(xì)胞。結(jié)果表明，3-IAA以劑量依賴的方式直接增加ROS。中性粒細(xì)胞或MPO的加入進(jìn)一步增強(qiáng)ROS在癌細(xì)胞中的積累，并且MPO的加入降低了小鼠和人類PDAC細(xì)胞系的活力。且直接加入3-IAA氧化產(chǎn)物MOI也增加了FIRINOX對(duì)小鼠和人類PDAC細(xì)胞的功效。

為了測(cè)試在小鼠體內(nèi)，3-IAA和FIRINOX處理對(duì)ROS誘導(dǎo)的影響，用3-IAA和FIRINOX或FIRINOX單獨(dú)處理SPF小鼠。通過流式細(xì)胞儀測(cè)量癌細(xì)胞中的ROS或在整個(gè)腫瘤組織學(xué)染色中測(cè)量硝基酪氨酸，結(jié)果顯示，與體外數(shù)據(jù)一致，用3-IAA和FIRINOX處理誘發(fā)高氧化應(yīng)激。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，與野生型骨髓重組小鼠相比，用3-IAA和FIRINOX處理后，Mpo-/-的癌細(xì)胞中的ROS水平要低很多，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)ROS產(chǎn)生和3-IAA氧化之間的聯(lián)系。隨后探究哪些氧化應(yīng)激相關(guān)的途徑參與了3-IAA和FIRINOX處理的腫瘤中ROS的積累。比較3-IAA和FIRINOX治療的小鼠的腫瘤和單獨(dú)用FIRINOX治療的小鼠的腫瘤，分析mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)中產(chǎn)生ROS或降解ROS的酶的表達(dá)。結(jié)果顯示，ROS降解酶谷胱甘肽過氧化物酶3（GPX3）和谷胱甘肽過氧化物酶7（GPX7）在體內(nèi)被下調(diào)，用3-IAA、FIRINOX和MPO處理導(dǎo)致體外KPC細(xì)胞中GPX3和GPX7的類似下調(diào)。敲除癌細(xì)胞中的Gpx3和Gpx7足以增加FIRINOX處理后的ROS積累，并增加癌細(xì)胞對(duì)FIRINOX的敏感性，其程度與3-IAA和FIRINOX相似。且敲除Gpx3足以在體內(nèi)建立對(duì)FIRINOX的敏感性。

接著，用ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)處理R-菌群（即高3-IAA）小鼠后，F(xiàn)IRINOX的療效消失，證明了ROS的積累對(duì)3-IAA和FIRINOX的療效至關(guān)重要（圖3a）。隨后驗(yàn)證高水平 ROS 的分子反應(yīng)，從3-IAA 和 FIRINOX 或單獨(dú)用 FIRINOX 治療的 SPF 小鼠中分離腫瘤并進(jìn)行靶向蛋白質(zhì)篩選和 mRNA 測(cè)序（圖3b）。結(jié)果表明，自噬是用3-IAA和FIRINOX治療的小鼠分離出的腫瘤中被下調(diào)的主要途徑之一，也是PDAC增殖和發(fā)展的重要代謝程序。此外，在用3-IAA和FIRINOX治療的SPF小鼠分離的腫瘤中，自噬底物L(fēng)C3B減少，p62/SQSTM增加（圖3c）。與此一致，與來自NR移植小鼠（低3-IAA）的腫瘤相比，來自R-菌群移植的小鼠（高3-IAA）的腫瘤也顯示出LC3B的豐度降低，p62/SQSTM1的豐度增加。在用3-IAA和FIRINOX治療的小鼠中，LC3B和p62/SQSTM的變化伴隨著腫瘤細(xì)胞增殖的下降，但未觀察到凋亡細(xì)胞數(shù)量的變化（圖3c）。

為了探究自噬的下調(diào)是否是解釋3-IAA和FIRINOX協(xié)同作用的一個(gè)重要下游機(jī)制，或者它是否僅僅與觀察到的癌細(xì)胞增殖的減少有關(guān)。首先，觀察到用海藻糖處理導(dǎo)致自噬報(bào)告細(xì)胞中GFP/RFP比例的下降，可以使自噬活性正?；▓D3d）。其次，海藻糖足以完全逆轉(zhuǎn)3-IAA和FIRINOX的治療效果，與ROS清除劑NAC類似（圖3e,f）。第三，用自噬阻斷劑羥氯喹處理可以使來自NR-菌群移植小鼠（低3-IAA）的腫瘤對(duì)FIRINOX治療敏感（圖3g）。最后，通過多西環(huán)素誘導(dǎo)的顯性失活A(yù)TG4B蛋白（mSt-ATG4B）抑制癌細(xì)胞的自噬，與對(duì)照細(xì)胞（mSt）或沒有多西環(huán)素處理的mSt-ATG4B細(xì)胞相比，SPF小鼠對(duì)FIRINOX治療的敏感性增加?？傊?，當(dāng)FIRINOX治療期間存在3-IAA和MPO時(shí)，ROS的積累增加，癌細(xì)胞的應(yīng)激適應(yīng)能力受損（即自噬作用被削弱），最終誘發(fā)腫瘤細(xì)胞的增殖減少。

?圖3?? 用3-IAA和化療導(dǎo)致自噬活性降低

3-IAA具有臨床治療潛力

為了研究3-IAA的潛在治療意義，測(cè)試了用3-IAA和FIRINOX對(duì)小鼠生存的影響、3-IAA和FIRINOX單獨(dú)使用都不能延長小鼠的生存時(shí)間，但是二者聯(lián)合可以顯著延長小鼠的生存時(shí)間（圖4a）。還發(fā)現(xiàn)，3-IAA與FIRINOX在治療結(jié)直腸癌（MC38）或肺癌（LLC）方面、3-IAA與GnP在治療PDAC小鼠模型中也有協(xié)同作用，這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了3-IAA在癌癥治療中的潛在作用。

隨后在臨床上進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，對(duì)化療有反應(yīng)的患者的中性粒細(xì)胞減少率較高，這與的小鼠數(shù)據(jù)和已知的中性粒細(xì)胞減少與PDAC預(yù)后之間的關(guān)系一致。且化療后中性粒細(xì)胞減少的水平，而非淋巴細(xì)胞或單核細(xì)胞減少的水平，與3-IAA血清濃度相關(guān)，這是由于它們的MPO水平不同而預(yù)期的（圖4b-d）。此外，在漢堡PDAC臨床隊(duì)列中，觀察到血清3-IAA濃度與無進(jìn)展生存期（PFS）或總生存期存在顯著相關(guān)性（圖4f、g），并在路德維希-馬克西米利安大學(xué)醫(yī)院（LMU）的第二個(gè)mPDAC患者隊(duì)列（慕尼黑隊(duì)列）驗(yàn)證了這些發(fā)現(xiàn)（圖4h,i）。這同時(shí)揭示了已有的臨床可評(píng)估的標(biāo)記物在預(yù)測(cè)化療反應(yīng)方面的缺失，且患者固有特異性（年齡、性別和體重）和腫瘤特異性（腫瘤大小和腫瘤標(biāo)記物）變量均與PFS無顯著相關(guān)性（圖4e）。

?圖4?? 3-IAA在PDAC中具有臨床治療潛力

小結(jié)

本研究利用16S rRNA測(cè)序和代謝組檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)菌群衍生的色氨酸代謝物吲哚-3-乙酸（3-IAA）在對(duì)治療有效患者中增加。糞便菌群移植、短期膳食補(bǔ)充色氨酸和口服3-IAA可以增加PDAC小鼠模型的化療療效。機(jī)制上，腸道中的脆弱擬桿菌和多形擬桿菌等，將人體攝入的色氨酸代謝成3-IAA；隨后3-IAA從腸道進(jìn)入血液，被中性粒細(xì)胞所吸收，在骨髓過氧化物酶的作用下，3-IAA轉(zhuǎn)化成一種毒性分子，導(dǎo)致癌細(xì)胞內(nèi)活性氧水平上升，抑制癌細(xì)胞的自噬作用，并最終影響了癌細(xì)胞增殖。最后，在兩個(gè)獨(dú)立的PDAC隊(duì)列中驗(yàn)證了3-IAA的水平和化療療效顯著相關(guān)?？傊狙芯看_定了一種菌群衍生的代謝物在PDAC的治療中具有臨床意義，為飲食聯(lián)合化療治療難治癌癥的臨床研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

Microbiota-derived 3-IAA influences chemotherapy efficacy in pancreatic cancer. Nature. 2023.

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本研究是由代謝組學(xué)-代謝物發(fā)現(xiàn)為驅(qū)動(dòng)的創(chuàng)新研究范本，此類研究具有最高的原創(chuàng)性。本公司經(jīng)典的已獲得客戶高度肯定的Q300全定量檢測(cè)技術(shù)和升級(jí)的新品Q1000技術(shù)，均可精確捕捉到腸道菌群代謝途徑中所有小分子產(chǎn)物的細(xì)微改變，涵蓋SCFAs、TMAO類、膽汁酸、吲哚類等諸多腸道菌群相關(guān)代謝物。目前Q300技術(shù)已助力客戶在Gut、Advanced Science、Diabetes Care、Nature Communications、PNAS等期刊發(fā)表近60篇SCI文章，平均IF>9分。

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