網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)專題 | IF14！中藥代謝組+網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究牛樟芝治療肝癌

邁維代謝

2023.2.03

?前言

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究自2020開始一直處于火熱的階段，同時也因為其簡單易操作帶來了許多問題，而為了保證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的健康發(fā)展，由世界中醫(yī)藥學(xué)會聯(lián)合會網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)專業(yè)委員會、清華大學(xué)主持制訂了國際第一部《網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評價方法指南》，也一定程度上規(guī)范了未來網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究內(nèi)容，既然如此，我們就一起來看一下，在指南下的如何通過結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究發(fā)表高分期刊，獲取可靠的研究結(jié)果。

牛樟芝通過在體外和體內(nèi)靶向PI3K/AKT 介導(dǎo)的細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)揮抗肝癌作用

●期刊：Acta Pharmaceutica Sinica B

●IF：14.903

●發(fā)表時間：2021.7

研究背景

肝細(xì)胞癌(HCC)被認(rèn)為是最常見的肝癌亞型，是全球癌癥相關(guān)死亡率的第四大原因，這不僅是由于其高擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率，而且還由于治療效果。目前，多種藥物，如索拉非尼和瑞戈非尼，均能提高HCC患者的總體生存率。然而，這些藥物存在一些問題，包括作用時間短、耐藥性等問題。因此，尋找安全、高效、低毒、逆轉(zhuǎn)耐藥的新藥迫在眉睫。

作為補(bǔ)充和替代醫(yī)學(xué)的主流形式，中醫(yī)藥（TCM）因其有益的效果和沒有嚴(yán)重的副作用而被癌癥患者廣泛接受。牛樟芝是一種稀有菌類，生長于中國臺灣，分布于海拔200-2000?m的闊葉林中。藥理研究表明，牛樟芝具有抗腫瘤、保肝、免疫調(diào)節(jié)、抑制血管新生內(nèi)膜形成、降低血壓和膽固醇、抑制血小板聚集等生理活性。在眾多功能中保肝作用，尤其是抗HCC是最常報道的。牛樟菌可以降低HCC 細(xì)胞活力、增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而，尚未闡明牛樟菌在抗 HCC中的主要作用和機(jī)制。

如今，牛樟芝以發(fā)酵酒或純培養(yǎng)的粉末、片劑、滴丸和膠囊的形式在市場上銷售，并逐漸成為臺灣最受歡迎的保肝劑和保健品之一。最近的研究表明，牛樟芝含有多種生理活性化合物，包括萜類、腺苷、有機(jī)鍺、微量元素、蛋白質(zhì)、麥角甾醇、維生素、煙酸、核酸凝集素、甲殼素、木質(zhì)素等。然而，目前有關(guān)牛樟芝化學(xué)指紋圖譜的報道較為零散，缺乏系統(tǒng)研究。此外，對牛樟芝的研究主要集中在單個成分的治療效果或定量分析上。從整體的角度來看，全面的化學(xué)指紋以及化學(xué)成分、分子靶點、信號通路和抗HCC 活性之間的相關(guān)性仍然難以捉摸。

研究思路

研究結(jié)果

1.?牛樟芝的化學(xué)成分鑒定及靶點收集分析

通過代謝組學(xué)技術(shù)手段共鑒定到139個物質(zhì)，包含102個萜類、8個苯環(huán)型、2個嘌呤核苷酸和22個其他類。

■?■?■?■?■

圖1?antcin A物質(zhì)鑒定結(jié)果

對ACDPs中鑒定得到的成分利用SWISS ADME數(shù)據(jù)庫篩選用于下一步的靶標(biāo)預(yù)測分析的成分，篩選的成分必須滿足兩個條件：首先，胃腸道吸收（GI absortion）設(shè)置為“HIGH”作為藥物吸收的條件，用于篩選具有良好口服生物利用度的活性化合物。其次，在五種預(yù)測性質(zhì)（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）中具有“YES”的兩種或多種化合物可以被視為活性成分。其中有72種活性成分具有高胃腸道吸收和適當(dāng)?shù)乃幬锵嗨菩浴?/p>

對滿足篩選條件的成分使用Swiss TargetPrediction 用于預(yù)測化合物的靶標(biāo)，篩選條件設(shè)定為可能性>0.12；同時，從NAPSS數(shù)據(jù)庫中下載了關(guān)于ACDPs已驗證目標(biāo)的信息，與前面得到的靶標(biāo)信息進(jìn)行合并，并構(gòu)建成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)（圖2A）。然后，對整合的目標(biāo)進(jìn)行GO和KEGG的富集分析（圖2B、C）。GO富集分析表明，ACDPs的靶點與ERK1和ERK2級聯(lián)的正調(diào)控，炎癥反應(yīng)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控，細(xì)胞增殖的正調(diào)控等密切相關(guān)（圖2B）。KEGG通路富集分析表明，ACDPs的靶點在癌癥、乙型肝炎、FoxO信號通路、胰島素抵抗等通路中顯著富集（圖2C）。

■?■?■?■?■

圖2?牛樟芝成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖及靶點GO/KEGG富集分析

2.?肝癌疾病靶點（標(biāo)志物）預(yù)測

■?■?■?■?■

圖3?肝癌靶點預(yù)測流程及結(jié)果

1.利用登錄在GEO上的肝癌相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析

在GSE14520、GSE45267、GSE64041和GSE112790的數(shù)據(jù)集中總共獲得了514個HCC樣本和341個正常樣本。如圖4A-D 所示，PCA的結(jié)果表明，每個樣本中的腫瘤和正常組織樣本數(shù)據(jù)集來自不同人群，說明樣本來源可靠。然后，在ggplot2可視化后，limma包分析差異表達(dá)基因（DEGs）的熱圖如圖4I-L所示。聚類熱圖結(jié)果證明，DEGs可以區(qū)分腫瘤組織和正常組織，因此DEGs可以代表整個樣本。接著通過Robust Rank Aggreg (RRA)整合DEG，獲得293個DEG，包括120個上調(diào)基因和173 個下調(diào)基因（圖4M）。DKK1、REG3A、DEFB1、MMP12和LCN2是前五位上調(diào)基因，而STAB2、CLEC1B、CXCL14、FCN3和ASPM是前五位下調(diào)基因。

■?■?■?■?■

圖4?GEO獲得的肝癌表達(dá)數(shù)據(jù)分析

(A)-(D) GSE14520、GSE45267、GSE64041和GSE112790的PCA圖。 (E)-(H) GSE14520、GSE45267、GSE64041和GSE112790中DEG的火山圖。(I)-(L) GSE14520、GSE45267、GSE64041和 GSE112790中DEG的熱圖。(M) TOP 20上調(diào)和下調(diào)DEG的熱圖。

2.利用GEO得到的差異表達(dá)基因，進(jìn)一步在TCGA 數(shù)據(jù)庫中繼續(xù)篩選。

TCGA數(shù)據(jù)庫中包含374個HCC組織和50個正常組織。生存分析表明，來自HCC患者的113個DEG與總生存率（期）顯著相關(guān)。ROC分析顯示，來自HCC患者的41個DEG與腫瘤的識別顯著相關(guān)。在LIHC中，對總生存率（期）有顯著影響的DEGs是AURKA、CCNB1、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）、SUMO激活酶亞基1（SAE1）和拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα（TOP2A），這些基因的相應(yīng)ROC曲線展示在圖5。通過結(jié)合對總生存率（期）和腫瘤鑒定具有重要意義的LIHC結(jié)果，獲得了與HCC密切相關(guān)的41個DEG（41個上調(diào)基因）。

■?■?■?■?■

圖5?靶標(biāo)生存分析和ROC分析

3.DisGeNET數(shù)據(jù)庫獲取肝癌靶標(biāo)

在DisGeNET數(shù)據(jù)庫中有5725個與HCC相關(guān)的條目。通過將閾值設(shè)置為0.5，收集了40個HCC靶標(biāo)。最后通過合并這些靶標(biāo)，獲得了79個HCC的靶標(biāo)（生物標(biāo)志物）。

3.?網(wǎng)絡(luò)分析

將通過成分預(yù)測的靶點和疾病預(yù)測的靶點進(jìn)行交叉分析，獲得ACDPs中與HCC相關(guān)15個靶標(biāo)（圖6A）。然后將這些靶標(biāo)使用STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape建立了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)。基于此，使用了MCODE計算PPI網(wǎng)絡(luò)中具有特殊功能的模塊的插件。篩選模塊化分析得分≥4，共收集到CCNB1、CASP8、CCNE1、CDK1、PIK3CA、MET、AURKA、TOP2A和TERT等9個靶點。這些靶點的KEGG通路富集分析表明，它們顯著富集了磷酸肌醇3激酶（PI3K）/AKT和細(xì)胞周期信號通路，例如癌癥通路、病毒致癌通路和P53信號通路（圖6B）。

同時，利用篩選得到的靶標(biāo)與ACDP的活性成分建立成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖（圖6C）。然后，使用分子對接方法來預(yù)測ACDP生物活性化合物與相應(yīng)靶蛋白之間的相互作用。結(jié)果zhankuic acid E 與CDK1、PIK3CA和CCNE1具有潛在的高結(jié)合親和力，靈芝醇B與CDK1和PIK3CA具有潛在的高結(jié)合親和力，靈芝酚與CCNE1具有潛在的高結(jié)合親和力，靈芝酚A具有與TERT的潛在高結(jié)合親和力等等?；钚曰衔锖偷鞍踪|(zhì)的三維和二維結(jié)合模式如圖6D和E。綜合起來，這些結(jié)果表明ACDPs可能通過降低細(xì)胞表達(dá)PI3K/AKT信號級聯(lián)調(diào)節(jié)的循環(huán)相關(guān)蛋白而發(fā)揮抗肝癌作用。

■?■?■?■?■

圖6?成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及分子對接分析

4.?驗證實驗

1.體外實驗

為了進(jìn)一步驗證ACDPs對HCC細(xì)胞的影響，利用體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞系HepG2、Huh-7和SMMC-7721進(jìn)行實驗。

首先，使用細(xì)胞計數(shù)實驗CCK-8測定法檢查了ACDPs對細(xì)胞活力的影響。用不同濃度（0、0.4、0.8、1.6和3.2 mg/mL）的ACDP預(yù)處理細(xì)胞24或48小時。結(jié)果表明用ACDP處理細(xì)胞劑量和時間依賴性地抑制HCC細(xì)胞的活力（圖7A-C）。然后，同時利用平板克隆形成實驗進(jìn)一步證明了ACDPs在體外具有合理的抗肝癌作用（圖7D），與CCK-8測定的結(jié)果一致。此外，通過細(xì)胞增殖實驗EdU 測定證實了ACDP的抗增殖作用（圖7E-G）。

其次根據(jù)信息學(xué)結(jié)果，ACDPs可能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)。Western blot檢測Huh-7細(xì)胞cyclin E1和CDK1的表達(dá)。如圖7H所示，在ACDPs刺激后它們顯著減少。除此之外還發(fā)現(xiàn)，在ACDPs刺激下，cleaved-caspase 8的表達(dá)增加。同時，ACDPs降低了PIK3CA的表達(dá)和AKT的活性?？傊?，ACDPs可以通過PI3K/AKT信號通路在肝癌中發(fā)揮抗癌作用。

■?■?■?■?■

圖7?體外實驗驗證

2.體內(nèi)實驗

為進(jìn)一步驗證ACDPs的抗腫瘤作用并探索其體內(nèi)可能機(jī)制，建立了BALB/c小鼠HCC模型。

與模型組相比，ACDPs以劑量依賴性方式抑制小鼠腫瘤生長（圖8A和B）。給予200和400 mg/kg/天ACDPs后，腫瘤重量分別減少了48%和67%，并且顯著減少了腫瘤體積（圖8C和D）。同時統(tǒng)計了各組小鼠的體重變化曲線，表明ACDPs沒有明顯的毒副作用。

免疫組化染色檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)水平和PI3K/AKT信號通路的活性。cyclin E1、CDK1、PIK3CA、p-AKT和AKT的表達(dá)水平顯著降低，而cleaved-caspase 8的表達(dá)水平升高（圖8E）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，ACDPs誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制與誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和阻斷PI3K/AKT信號通路相關(guān)。

■?■?■?■?■

圖8?體內(nèi)實驗驗證

本文亮點

1.本研究首先依賴于代謝組學(xué)技術(shù)手段，對中藥單方中的成分進(jìn)行鑒定，獲得可靠的成分?jǐn)?shù)據(jù)，這一步為后續(xù)的數(shù)據(jù)分析奠定了重要的基礎(chǔ)，也從根本上避免“同質(zhì)化”的問題。相較于只從目前中藥數(shù)據(jù)庫中獲取成分信息，既可以避免出現(xiàn)“異病同治”這種篩選到在中藥中普遍存在的物質(zhì)，也可以為中藥質(zhì)量標(biāo)志物Q-Marker選到在牛樟芝中的藥效特有物質(zhì)。

2.其次，本研究相較于以往的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，在疾病靶點篩選中，同時利用已有的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，能輔助在網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建中縮小需要重點關(guān)注的靶點數(shù)目；

3.最后，利用體內(nèi)外實驗對生物信息分析的結(jié)果進(jìn)行驗證，驗證結(jié)果也表明分析的方向和結(jié)果是無誤的，對于后續(xù)利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究不僅建立了極大的信心，同時也可以推動中藥方證藥理學(xué)的發(fā)展。

本文整體的研究思路也符合由世界中醫(yī)藥學(xué)會聯(lián)合會網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)專業(yè)委員會、清華大學(xué)主持制訂了國際第一部《網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評價方法指南》，也給了我們學(xué)習(xí)的思路。

中藥代謝組-網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)-驗證實驗研究解決方案：

除了學(xué)習(xí)到這篇文章中利用代謝組學(xué)技術(shù)手段來對中藥成分進(jìn)行鑒定，我們也可以同樣通過利用中藥飲片道地差異的成分來輔助藥效成分篩選，這一方法同樣適用于中藥復(fù)方進(jìn)行成分獲取。藥效成分獲取的越準(zhǔn)確，越有利于后續(xù)進(jìn)行靶點預(yù)測，最終也會決定藥效機(jī)制的闡述。