【知識分享】常溫下的液相色譜：液相色譜方法何時應(yīng)該設(shè)置準(zhǔn)確的溫度？

納譜分析

2023.2.01

在反相色譜中，提高柱溫通常會降低分析物的保留。在一個沒有控制柱溫的方法中，如果實驗環(huán)境溫度發(fā)生了變化，會出現(xiàn)什么問題？

在早期的液相色譜中，精準(zhǔn)控制色譜柱溫度并不是許多儀器設(shè)置中的首要考慮因素。不像氣相色譜，柱溫是決定保留的最重要的實驗變量，在液相色譜中，柱溫對于保留的影響相對流動相的組成來說要弱很多（也就是說，反相、親水色譜HILIC中有機(jī)相和水相的比例，或基于電荷分離方法中陰離子和陽離子濃度的比例對于分析物保留的影響重要的多）。

隨著大家對液相色譜中溫度影響的認(rèn)識在不斷提高，例如，進(jìn)一步了解了柱溫對于不同類型分析物保留的影響（1），色譜柱入口處流動相溫度與色譜柱溫度匹配的重要性（2），以及色譜柱中熱流對柱效的影響（3），精準(zhǔn)控制液相色譜柱溫度的需求也在不斷的增加。越來越多的色譜工作者已經(jīng)開始注意控制液相色譜儀的溫度（儀器廠家也早已設(shè)計出了相應(yīng)的儀器模塊），并且在開發(fā)和驗證方法的時候習(xí)慣明確規(guī)定一個溫度值或者溫度范圍。然而，現(xiàn)在還是有很多在用的方法上標(biāo)明的是“室溫”條件，而且大多時候方法中所指的“室溫”并沒有一個明確的定義。這樣就產(chǎn)生了一個很明顯的問題：類似這樣的方法，我們能否合理預(yù)期在阿拉斯加的安克雷奇和在印度的孟買能得到相同的分離效果？

在這期“液相色譜常見問題處理”中，我們將會討論液相色譜中溫度對化合物保留的影響的原理，并且以一些實驗數(shù)據(jù)來幫助我們理解如果允許“室溫”條件發(fā)生一些變化，將在什么情況下會嚴(yán)重影響化合物的分離。

反相液相色譜中柱溫對于化合物保留影響的原理

在反相液相色譜中，柱溫對化合物保留的影響通?？梢酝ㄟ^Van’t Hoff定律來進(jìn)行描述，如下所列的方程1：

k是分析物的保留因子，T是在這個k值下的溫度。變量A是一個特定條件下參數(shù)，與分析物從流動相到固定相之間熵的傳遞和相比（固定相體積和流動相體積的關(guān)系）有關(guān)，變量B則與分析物從流動相到固定相之間焓的傳遞有關(guān)。圖1顯示了在C18色譜柱，乙腈水為流動相的條件下，幾個中性小分子化合物在不同的溫度下的保留數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)大致呈線性變化的趨勢，如方程1所預(yù)測的一致。Weber團(tuán)隊通過大量的實驗數(shù)據(jù)對此進(jìn)行驗證，得出結(jié)論是方程式1的非線性版本比線性版本能更好的貼合實驗數(shù)據(jù)（1）。還有其他研究人員則提出了爭議，認(rèn)為數(shù)據(jù)呈現(xiàn)線性的表象更趨向于是一種巧合，而不是熱力學(xué)的必然性。

圖1.?幾個中性小分子化合物在C18色譜柱，乙腈水（50/50）作為流動相的條件下，柱溫（T）的變化對保留因子（k）的影響：（a）為甲苯，乙苯和丙苯；（b）為對硝基氯芐和苯甲醚。虛線為線性回歸線。數(shù)據(jù)來源于Yun Mao的博士學(xué)位論文（6）。

圖1中各直線的斜率與分析物從流動相到固定相之間焓的傳遞有關(guān)。對于化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的分子而言，這些斜率的數(shù)值相似，如圖1a中的甲苯，乙苯和丙苯所示數(shù)據(jù)。對于這些結(jié)構(gòu)類似化合物的分離，提高柱溫能夠減少分析物的保留，而不會對各峰之間的間距（也就是說選擇性）產(chǎn)生太大的變化，因為所有的峰都是以差不多相同的速率朝一個方向移動。然而，對于一些帶有不同官能團(tuán)的化合物，斜率則會差異很大，如圖1b中的對硝基氯芐和苯甲醚。在這類實例中，提高柱溫會減少分析物的保留，但由于變化速率不同，因此選擇性和分離度將會發(fā)生變化。極端的例子表明甚至還能導(dǎo)致洗脫順序發(fā)生變化（5）。大家若有興趣，可以簡單通過下面網(wǎng)站提供的模擬裝置進(jìn)行嘗試，在上面可以通過改變流動相組成和色譜柱溫度，然后觀察對保留和分離的影響(www.multidlc.org/hplcsim)。

讓我們來看看一些實驗的數(shù)據(jù)

在準(zhǔn)備寫這期“液相色譜常見問題處理”的時候，我給我們實驗室的一臺液相色譜儀制造了一個微環(huán)境。首先斷開色譜柱常用的柱溫箱，然后對微環(huán)境進(jìn)行加溫或者降溫，來模擬“室溫”的變化對于分離的影響，并且利用一個小熱電偶來測量色譜柱入口處附近環(huán)境的溫度。最后，我記錄了幾款簡單化合物（一個酸性，一個堿性，兩個中性化合物）在不同“室溫”條件下的色譜圖，每個溫度下系統(tǒng)都平衡了30分鐘。圖2為24、28和42 ℃三個“室溫”條件下的色譜圖。添加垂直虛線作為視覺輔助，有助于觀察隨著溫度的升高保留的變化。

圖2：測試物在不同溫度下的色譜圖。添加垂直虛線作為視覺輔助，助于對比保留時間。

條件：色譜柱50 mm x 4.6-mm i.d., Zorbax SB-C18 (5-μm)；流速1.0 ml/min；流動相，乙腈：甲酸銨水溶液（25mM銨鹽/氨水，105mM甲酸/甲酸鹽，pH3.2）40:60（v/v），進(jìn)樣量2 μL。測試化合物1）苯乙酮，2）去甲替林，3）苯丁酮，4）丁基苯甲酸

盡管這些變化肉眼可見，然而根據(jù)數(shù)據(jù)結(jié)果繪制出與溫度的函數(shù)關(guān)系能更準(zhǔn)確的了解這種影響，尤其是選擇性的變化。圖3清晰的表明了溫度對這四種目標(biāo)化合物保留的影響。在圖3a中，我繪制出了各溫度下保留因子的絕對值，在圖3b中，則繪制出了在測量溫度范圍內(nèi)的每種化合物保留因子與平均保留因子比值的百分比變化。果不其然，所有化合物的保留都隨著溫度的升高而減少，這是我們通過這個實驗得出的第一個要點(diǎn)?！笆覝亍钡淖兓隙芤鹦》肿踊衔锏谋Ａ舭l(fā)生大約2%的變化。在42 ℃下的數(shù)據(jù)誠然有點(diǎn)極端，甚至超出了美國實驗室室溫條件下的適用范圍，但是對于全球的液相色譜實驗室來說是有必要的。

在圖3b中，我們發(fā)現(xiàn)除了去甲替林曲線斜率更陡之外，其他曲線斜率的變化趨勢（k值變化的百分比與溫度T）基本一致。就像先前討論過的，如果所有化合物的保留隨著溫度變化以相同的速率發(fā)生同樣的變化，這種情況下，溫度的設(shè)置對于方法的執(zhí)行不會產(chǎn)生太大的問題，因為不會對分離度有什么影響。然而，圖3b中去甲替林保留變化的速率高出了其他化合物大約兩倍。

圖3：待測化合物在測試溫度范圍內(nèi)（21-42 ℃）保留因子(a)和保留因子百分比(b)的變化

通過繪制出選擇因子與溫度的變化曲線，我們能更準(zhǔn)確的看到相對保留上的這些變化。圖4a為不同溫度下幾對目標(biāo)化合物的選擇因子α值，圖4b為選擇因子α值變化百分比隨溫度的變化關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度從24 ℃升高到42 ℃，中性化合物（苯乙酮和苯丁酮）的選擇性沒有發(fā)生明顯的變化。甚至苯丁酮和丁基苯甲酸的選擇性也沒有發(fā)生明顯變化，盡管他們的化學(xué)性質(zhì)截然不同。即使丁基苯甲酸可電離，但在pH3.2條件下絕大多數(shù)還是呈中性狀態(tài)。另一方面，我們發(fā)現(xiàn)在所研究的溫度范圍內(nèi)，去甲替林的選擇因子的變化非常大。去甲替林與苯丁酮（紅圈）或丁基苯甲酸（藍(lán)圈）的α選擇因子比值變化接近5%。

圖4：待測化合物在測試室溫范圍內(nèi)（21-42 ℃）選擇因子(a)和選擇因子百分比(b)的變化

對方法開發(fā)和執(zhí)行可能造成的影響

到目前為止，我們觀察到溫度的變化可能對一些，但不是全部，類型的化合物在反相色譜分離上的選擇性產(chǎn)生明顯的影響。在實際應(yīng)用中很重要的問題是：在什么情況下這些變化會變得很重要？我所研究的幾個化合物分離的很好（圖2），即使5%選擇性的變化也不會導(dǎo)致它們達(dá)不到基線分離。然而，實際應(yīng)用中碰到的情況并不都是這樣。例如，在一個室溫條件下勉強(qiáng)達(dá)到分離的兩個相鄰的峰，當(dāng)換到另外一個室溫條件時，則可能會對這兩個峰的分離造成很大影響。我們可以通過Purnell方程（方程2）來定量這種影響。

我們假設(shè)柱效（N）為15000，兩個峰其中后出峰的保留因子（k）為5，選擇因子α為1.1，則兩個峰之間的分離度（Rs）則大約為2.3。我們可以通過方程2計算出選擇因子的變化對分離的影響。圖5中顯示了當(dāng)α值減少5%時（從1.1降低至1.045），分離度是如何降低的。分離度2.3意味著兩個峰分離度良好，達(dá)到了基線分離，然而分離度1.1則意味著兩個峰之間有部分重疊。重疊的峰則會嚴(yán)重影響方法的準(zhǔn)確定量，尤其是當(dāng)兩個物質(zhì)中一個物質(zhì)的濃度遠(yuǎn)高于另外一個的時候。

圖5：選擇性α的降低對兩個相鄰峰的分離度的影響。分離度通過Purnell方程（方程2）計算得出，假設(shè)N=15000，k=5，初始α=1.1

結(jié)論：

在這期“液相色譜常見問題處理”中，我們驗證了在沒控制柱溫的情況下，室溫的變化對于反相液相色譜分析性能的影響。在絕大多數(shù)的實例中顯示，增加溫度會導(dǎo)致反相色譜保留減弱。只要溫度的變化對相鄰兩個峰保留變化的影響都差不多，則不會對這兩個峰的分離有什么影響。然而，這并不能代表所有的情況，有時分離的選擇性發(fā)生大約百分之幾的明顯變化。而這些選擇性的變化會反過來導(dǎo)致相鄰峰之間分離度發(fā)生明顯的減少（或增加），而這些分離度的變化大約能達(dá)到50%！

總的來說，這意味著：

在方法開發(fā)的過程中明確規(guī)定“室溫”的條件，將有利于避免在方法執(zhí)行的過程中出現(xiàn)問題，尤其是該方法需要到各個不同環(huán)境的實驗室去得到執(zhí)行，而這些實驗室所處的室溫環(huán)境各不相同。

在方法開發(fā)的過程中，柱溫變化對方法影響的敏感程度，需要被列入方法穩(wěn)定性的考察之中。

用恒溫箱來控制色譜柱的柱溫能夠避免上述所有問題的發(fā)生，盡管是以增加了一個儀器模塊作為代價。

May 01, 2020

By?Dwight R. Stoll

LCGC North America?Volume 38, Issue 5, pg 261–268

參考文獻(xiàn)

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文章來源：網(wǎng)絡(luò)

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