AAV藥物關(guān)鍵質(zhì)量分析

基泰生物

2022.12.26

AAV全稱腺相關(guān)病毒，屬于細(xì)小病毒科的一類很特殊的病毒，它的尺寸非常小，只有20多個(gè)納米，相當(dāng)于兩三個(gè)抗體分子，因其安全性好、宿主細(xì)胞范圍廣、免疫源性低，在體內(nèi)表達(dá)外源基因時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，成為目前基因治療領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛使用的載體之一。

AAV病毒分為2類：

①AAV（無包膜的單鏈DNA病毒，基因組4.7kbp）病毒復(fù)制：Rep78、Rep68、Rep52、Rep40；病毒衣殼：VP1、VP2、VP3；指導(dǎo)基因組的復(fù)制和病毒載體組裝：ITRs。

②rAAV（重組AAV是人工改造的AAV）刪除編碼病毒蛋白的基因，保留ITRs；使得包裝容量最大化；降低免疫原性和細(xì)胞毒性。

AAV藥物關(guān)鍵質(zhì)量分析：

衣殼蛋白鑒別及純度：毛細(xì)管電泳，LC MS

AB SCIEX的PA800 Plus毛細(xì)管電泳制藥分析系統(tǒng)亦可對(duì)AAV的不同組裝狀態(tài)進(jìn)行分析。由于AAV衣殼表面的氨基酸側(cè)鏈會(huì)造成AAV具有特定的等電點(diǎn)（Isoelectric Point，pI），其內(nèi)部核酸的填充情況也會(huì)造成AAV等電點(diǎn)的差異，同時(shí)不同的血清型也可影響產(chǎn)品的等電點(diǎn)，所以通過用等電聚焦電泳模式對(duì)AAV載體進(jìn)行pI值檢測(cè)可用于AAV的種類鑒別及組裝情況的分析。

毛細(xì)管電泳還可進(jìn)行AAV的衣殼蛋白純度分析及宿主細(xì)胞殘留DNA（HCD）的片段分布檢測(cè)。AAV衣殼由三種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2和VP3）組成，其比例和純度都會(huì)影響藥物的效能和效價(jià)，需要被鑒定并監(jiān)控以確保藥物質(zhì)量，且AAV產(chǎn)品具有多種血清型，普遍濃度較低，需要一種針對(duì)不同血清型均具有較高分離度和靈敏度的分析方法。PA800 Plus采用激光誘導(dǎo)熒光的檢測(cè)方式對(duì)AAV衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行純度檢測(cè)，可將VP1、VP2、VP3進(jìn)行基線分離，檢出限可達(dá)1×109 GC/mL。

FDA關(guān)于人類基因治療新產(chǎn)品生產(chǎn)指導(dǎo)文件中明確指出HCD的片段要小于200 bp；NMPA生物制品藥學(xué)部同樣在基因治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則的征求意見稿中指出，HCD的片段要小于200 bp。PA800 Plus用激光誘導(dǎo)熒光的檢測(cè)方式可檢測(cè)10pg/mL的DNA片段濃度, 若在前處理的過程中對(duì)DNA進(jìn)行濃縮處理，還可獲得更高的檢測(cè)靈敏度，同時(shí)可檢測(cè)50bp-1000bp的片段大小，且可進(jìn)行條件優(yōu)化檢測(cè)長(zhǎng)至15kb的片段大小，滿足各種殘留DNA檢測(cè)的要求。

使用液相色譜和質(zhì)譜來表征腺相關(guān)病毒(aav)顆粒中的vp1衣殼蛋白、vp2衣殼蛋白和vp3衣殼蛋白以及aav組合物的純度的方法。

所述aav顆粒經(jīng)受液相色譜，其中通過質(zhì)譜和/或紫外(uv)-可見光光譜測(cè)定vp1衣殼蛋白、vp2衣殼蛋白和vp3衣殼蛋白的質(zhì)量和比率。在一些方面，通過質(zhì)譜測(cè)定所述衣殼蛋白的單獨(dú)質(zhì)量。在一些方面，所述aav顆粒上的衣殼在所述液相色譜的柱上變性為單獨(dú)的vp1、vp2和vp3蛋白。在一些方面，通過所述液相色譜來分離所述衣殼蛋白。

另外，病毒衣殼蛋白需要由正確的蛋白序列制成，并且它們通常需要加上特定的翻譯后基團(tuán)才能在細(xì)胞中充分發(fā)揮活性。這方面質(zhì)量研究，可通過肽圖分析方法進(jìn)行檢測(cè)。通過液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS / MS）可完成相關(guān)肽圖分析，它可繪制出AAV顆粒在細(xì)胞中發(fā)揮正常功能所需的主要蛋白質(zhì)序列和翻譯后修飾信息。