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知識的力量 | STTT 高分教程：如何提高CAR-T效力以及持久性
「實(shí)體瘤CAR-T 新進(jìn)展」
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胸膜和腹膜轉(zhuǎn)移伴惡性胸腔積液(MPE)或惡性腹水(MA)常發(fā)生于晚期肺癌、乳腺癌、胃腸道腫瘤和卵巢癌的患者。CAR-T作為一種新興的腫瘤治療方法已經(jīng)在血液瘤治療中取得突破療效，然而在實(shí)體瘤特別是在胸腹腔惡性積液的免疫抑制環(huán)境中，CAR-T受到免疫抑制并導(dǎo)致細(xì)胞失能。
2022年11月19日，四川大學(xué)王永生及李丹共同通訊在Signal Transduction and Targeted Therapy（STTT, IF=38）在線發(fā)表題為“A PD-L1-targeting chimeric switch receptor enhances efficacy of CAR-T cell for pleural and peritoneal metastasis”的研究論文。
該研究證明了MPE/MA中的免疫抑制環(huán)境導(dǎo)致二代CAR-T細(xì)胞殺傷功能出現(xiàn)障礙（圖1），然后研究者發(fā)現(xiàn)PD-L1在病人的MPE/MA細(xì)胞中廣泛表達(dá)（圖2），基于這一特性， 研究者設(shè)計(jì)了一種新型PD-L1靶向嵌合轉(zhuǎn)換型受體（PD-L1.BB CSR）（圖3），可以和PD-L1結(jié)合并將抑制信號轉(zhuǎn)化為4-1BB的胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，4-1BB作為常用的CAR-T共刺激分子，激活后將增強(qiáng)T細(xì)胞IL-2, IFN-γ的分泌以及增殖。當(dāng)PD-L1.BB CSR與靶向HER2的二代CAR（HER2.28ζ CAR）共表達(dá)時就構(gòu)成了一種新型的雙靶點(diǎn)以及雙共刺激信號的CAR（HER2.28ζ/PD-L1.BB CAR，圖3&4）。
圖1. 不同二代CAR-T細(xì)胞與病人胸水共培養(yǎng)后出現(xiàn)殺傷功能障礙
圖2.不同病人惡性胸腹水樣本（CD45-/CD45+細(xì)胞）中PD-L1都有不同程度的表達(dá)（l）,正常Dornor T細(xì)胞與不同病人惡性胸腹水共培養(yǎng)后PD-L1的表達(dá)上調(diào)（m）
圖3. 不同CAR的慢病毒載體結(jié)構(gòu)示意圖
圖4. Novocyte流式細(xì)胞儀檢測不同CAR的表達(dá)
PD-L1.BB CSR修飾的二代CAR-T在培養(yǎng)基和MPE/MA中均表現(xiàn)出優(yōu)越的適應(yīng)性和增強(qiáng)的殺傷功能，利用xCELLigence RTCA系統(tǒng)評估CAR-T細(xì)胞的實(shí)時連續(xù)殺傷，HER2.28ζ/PD- L1.BB CAR-T展現(xiàn)出更強(qiáng)的殺傷能力（圖5），利用Novocyte流式細(xì)胞儀檢測HER2.28ζ/PD- L1.BB CAR-T在培養(yǎng)基和MPE/MA中均有更高的TCM（中央記憶T細(xì)胞）比例，提示HER2.28ζ/PD- L1.BB CAR-T有更強(qiáng)的效力以及更加持久的抗腫瘤作用（圖6）。
在體內(nèi)異種移植小鼠模型中HER2.28ζ/PD- L1.BB CAR-T更加快速持久的清除胸膜（A549-Luc）和腹膜轉(zhuǎn)移瘤(SKOV3PDL1-Luc)，并在輸注30天后實(shí)現(xiàn)所有小鼠Tumor-free（圖7）。
進(jìn)一步研究證明，PD-L1.BB CSR 參與上調(diào) HER2.28ζ/PD-L1.BB CAR-T 細(xì)胞中的T細(xì)胞活化、細(xì)胞毒性和增殖相關(guān)基因表達(dá)。其中PD-L1 scFv和4-1BB胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域?qū)D-L1.BB CSR修飾的二代CAR-T細(xì)胞的功能改進(jìn)起重要作用。
圖5.xCELLigence RTCA系統(tǒng)評估CAR-T細(xì)胞的實(shí)時連續(xù)殺傷，HER2.28ζ/PD-L1.BB CAR-T展現(xiàn)出更強(qiáng)的殺傷能力
圖6. Novocyte流式細(xì)胞儀檢測不同CAR-T TCM（CD45RO+CCR7+）亞群比例，HER2.28ζ/PD-L1.BB CAR-T與MPE共培養(yǎng)后也展現(xiàn)更高的TCM比例
圖7. HER2.28ζ/PD-L1.BB CAR-T輸注30天后完全清除腹腔CDX模型小鼠體內(nèi)的SKOV3PDL1-Luc腫瘤細(xì)胞
總之，該研究揭示了基于復(fù)雜腫瘤環(huán)境對傳統(tǒng)二代CAR-T優(yōu)化的必要性，作者根據(jù)胸腹膜種植轉(zhuǎn)移患者的PD-L1廣泛表達(dá)的免疫抑制腫瘤環(huán)境，設(shè)計(jì)了PD-L1.BB CSR修飾的雙靶CAR-T，顯著提高了傳統(tǒng)二代CAR-T的適應(yīng)性。基于該研究，一項(xiàng)I期臨床試驗(yàn)在胸膜或腹膜轉(zhuǎn)移患者中啟動(NCT04684459)，有望于通過局部輸注治療胸腹腔復(fù)發(fā)的晚期腫瘤病人并延長生存期（圖8）。
圖8. 胸腔/腹腔積液中CAR-T細(xì)胞的模擬治療作用圖
總結(jié)
值得一提的是，本研究中安捷倫Novocyte 流式細(xì)胞儀的應(yīng)用貫穿整個研究過程，從體外研究樣本到臨床樣本以及動物實(shí)驗(yàn)樣本，Novocyte均交出了完美的結(jié)果；同時本研究還應(yīng)用了xCELLigence RTCA實(shí)時細(xì)胞分析儀，區(qū)別于傳統(tǒng)終點(diǎn)檢測方法學(xué)實(shí)驗(yàn)，RTCA可以實(shí)時連續(xù)以及特異性的檢測靶細(xì)胞的殺傷。安捷倫細(xì)胞分析產(chǎn)品以創(chuàng)新角度助力抗癌新藥研發(fā)，并提供更廣泛的解決方案，與研究者一樣我們同樣期待并致力于更有效的新藥面世!
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