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應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)：直接測(cè)量細(xì)胞代謝以識(shí)別線粒體藥物靶點(diǎn)
前言
藥物靶點(diǎn)識(shí)別在藥物發(fā)現(xiàn)價(jià)值鏈中起到關(guān)鍵作用。藥物開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵步驟是識(shí)別潛在候選藥物的直接靶點(diǎn)并區(qū)分任何繼發(fā)或脫靶效應(yīng)。
藥物靶點(diǎn)識(shí)別的方法之一是表型篩選，涉及向細(xì)胞（或較小的模型生物）中添加化合物并測(cè)量對(duì)目標(biāo)表型或細(xì)胞活性的影響1。對(duì)于對(duì)表型或細(xì)胞功能具有所期望的影響的化合物，必須識(shí)別活性化合物直接擾亂的基因或基因產(chǎn)物（即，靶點(diǎn)）。因此，藥物開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵步驟是識(shí)別活性化合物的直接靶點(diǎn)以及該化合物可能影響進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的任何繼發(fā)或脫靶效應(yīng)。
圖 1. 按年份繪制的 PubMed 中包括關(guān)鍵詞“線粒體”、“藥物”和“靶點(diǎn)”的出版物的數(shù)量
近年來(lái)，已經(jīng)確定線粒體和細(xì)胞代謝過(guò)程除具有眾所周知的底物氧化和 ATP 生成作用以外，還是細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、免疫細(xì)胞應(yīng)答、缺氧感受和細(xì)胞凋亡的核心2-4。實(shí)際上，線粒體和代謝功能障礙越來(lái)越多地與眾多病理聯(lián)系在一起，其中包括癌癥、免疫細(xì)胞和系統(tǒng)疾病、神經(jīng)退化、心臟病、肥胖和糖尿病以及衰老過(guò)程5-7。于是，人們對(duì)線粒體和代謝藥物靶點(diǎn)的關(guān)注大幅增加（圖 1）。因此，相應(yīng)地需要對(duì)代謝通路功能進(jìn)行高靈敏度直接測(cè)量，以闡明潛在候選藥物的特異性（及任何可能的非特異性）靶點(diǎn)。
安捷倫 Seahorse XF Pro 分析儀以多孔板形式直接測(cè)量活細(xì)胞中的線粒體呼吸和細(xì)胞代謝。因此，該系統(tǒng)是用于檢測(cè)以線粒體和其他代謝通路（如糖酵解）為靶標(biāo)的藥物的功能效應(yīng)的理想選擇。本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)提供了可用于代謝靶點(diǎn)識(shí)別研究的Seahorse XF 應(yīng)用和工作流程的總體概述。
未來(lái)，本系列應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)將探討如何使用這些分析來(lái)闡明藥物化合物的特異性和非特異性靶點(diǎn)的有趣案例。
用于線粒體和代謝藥物靶點(diǎn)識(shí)別的 Seahorse XF 工作流程
本工作流程分為一系列分析，旨在解答以下主要問(wèn)題：
1. 化合物是否影響線粒體或代謝功能？
2. 化合物的特異性靶點(diǎn)是什么？
3. 是否存在任何非特異性或脫靶效應(yīng)？
對(duì)于在表型篩選中表現(xiàn)為有效的化合物（例如，藥物 X），執(zhí)行安捷倫 Seahorse XF 細(xì)胞線粒體壓力測(cè)試 (MST) 以確定化合物是否影響線粒體功能8, 9。該分析通過(guò)測(cè)定耗氧率（圖 2，左圖），對(duì)線粒體呼吸的幾個(gè)關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了檢測(cè)。其中發(fā)生變化的參數(shù)（以及變化幅度）提供了有關(guān)化合物是否改變線粒體功能的信息10, 11。該分析的結(jié)果還可以確定后續(xù)最適合采用哪種類(lèi)型的 XF 分析設(shè)計(jì)來(lái)采集更具體的信息（包括藥物靶點(diǎn)識(shí)別）。例如對(duì)于藥物 X，該工作流程將應(yīng)用于眾所周知的線粒體丙酮酸載體抑制劑 UK509910。
圖 2（右圖）顯示了在缺乏和存在 UK5099 時(shí)的 MST 結(jié)果。數(shù)據(jù)表明，UK5099 確實(shí)影響線粒體功能，表現(xiàn)在基礎(chǔ)呼吸速率和最大呼吸速率均有所下降。
藥物 X 是否影響線粒體功能？
圖 2. 左圖：安捷倫 Seahorse XF 細(xì)胞線粒體壓力測(cè)試分析設(shè)計(jì)和輸出參數(shù)；右圖：用 UK5099 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理后的 MST
接下來(lái)，必須考慮代謝的哪些部分可能會(huì)驅(qū)動(dòng)這種變化。UK5099 的 MST 圖譜表明，在底物氧化和/或電子傳遞鏈/氧化磷酸化通路中發(fā)生了功能障礙11。這些通路包括底物轉(zhuǎn)運(yùn)和速率控制蛋白質(zhì)和酶的活性，包括谷氨酰胺酶、CPT1a、丙酮酸脫氫酶 (PDH)、TCA 循環(huán)酶、電子傳遞和氧化磷酸化機(jī)制。
為確定 UK5099 的效果，使用安捷倫 Seahorse XF 細(xì)胞膜通透劑 (PMP)。細(xì)胞膜透化使得提供的底物可直接進(jìn)入線粒體中，而無(wú)須將線粒體與細(xì)胞物理分離10, 12, 13。由于不同的可氧化底物參與不同的代謝通路，因此提供了特定底物的透性化細(xì)胞的呼吸速率可用于識(shí)別靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)在受到調(diào)節(jié)后引起可在完整細(xì)胞中觀察到的線粒體呼吸變化。圖 3 簡(jiǎn)單概述了丙酮酸、谷氨酸和琥珀酸的底物依賴性通路，更多信息參見(jiàn)參考文獻(xiàn)10 的圖 S3。
因此，工作流程中的下一步 XF 分析是在存在和缺乏候選藥物UK5099 的情況下將這三種底物分別提供給透性化細(xì)胞。如圖 4 所示，UK5099 僅在丙酮酸作為底物時(shí)阻止呼吸；向各種類(lèi)型的透性化細(xì)胞（HskMM、NRVM 和原代皮層神經(jīng)元）提供谷氨酸或琥珀酸時(shí)無(wú)效?？偠灾@些結(jié)果表明：呼吸復(fù)合物 I 和復(fù)合物 II 都不是 UK5099 的靶點(diǎn)，并且 UK5099 對(duì)呼吸的抑制必定位于復(fù)合物 I 和 TCA 循環(huán)的上游，因?yàn)楣劝彼幔◤?fù)合物 I 底物）或琥珀酸（TCA/復(fù)合物 II 底物）氧化都不受影響。此外，這些結(jié)果還表明丙酮酸脫氫酶 (PDH) 或線粒體丙酮酸載體 (MPC) 可能是 UK5099 的靶點(diǎn)。然后可以進(jìn)一步分析透性化細(xì)胞和替代底物以區(qū)分 PDH 和 MPC，如同證明 MPC 是 UK5099 的特異性靶點(diǎn)一樣10。
圖 3. 丙酮酸、谷氨酸和琥珀酸線粒體氧化通路的簡(jiǎn)單示意圖。復(fù)合物 I 和復(fù)合物 II 底物和通路分別顯示為紅色和藍(lán)色。請(qǐng)注意：丙酮酸和谷氨酸都提供 NADH 給 CI，而琥珀酸提供FADH2 給 CII。MPC：線粒體丙酮酸載體；PDH：丙酮酸脫氫酶。為清楚起見(jiàn)，省略了復(fù)合物 V 及其他氧化磷酸化組分
圖 4. 提供丙酮酸 (Pyr)/蘋(píng)果酸、谷氨酸 (Glu)/蘋(píng)果酸或琥珀酸 (Succ)/魚(yú)藤酮作為唯一底物的透化性細(xì)胞的呼吸；UK5099 僅抑制丙酮酸驅(qū)動(dòng)的呼吸。HSkMM：人骨骼肌成肌細(xì)胞；NRVM：新生大鼠心室肌細(xì)胞；皮層神經(jīng)元：大鼠原代皮層神經(jīng)元。摘自參考文獻(xiàn) 11
總結(jié)
我們對(duì)代謝作用的理解已經(jīng)從簡(jiǎn)單的“管家”演變?yōu)樵S多正常和疾病狀態(tài)的核心參與者。在活細(xì)胞中檢測(cè)化合物對(duì)線粒體功能和代謝表型的影響，提供了一條識(shí)別代謝調(diào)節(jié)靶點(diǎn)的通路。此方法補(bǔ)充了其他方法，例如以信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和細(xì)胞受體為靶標(biāo)的方法。除 ETC 和氧化磷酸化以外，本文所概述的示例強(qiáng)調(diào)了考慮多條線粒體通路（包括底物轉(zhuǎn)運(yùn)和線粒體酶活性）的重要性。通過(guò)將線粒體和代謝功能的直接基于細(xì)胞的測(cè)量結(jié)合到藥物靶點(diǎn)識(shí)別研究中，可以獲得有關(guān)化合物的特異性和非特異性效應(yīng)的重要見(jiàn)解。
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