深度剖析 | NovoCyte Quanteon流式細(xì)胞儀對小鼠造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞進(jìn)行14色表型分析

安捷倫細(xì)胞分析

2022.11.03

臨床上已成功將骨髓中分離出的造血干/祖細(xì)胞（HSPCs）用于造血干細(xì)胞移植多年，并可以利用一系列細(xì)胞表面標(biāo)記物對這些細(xì)胞進(jìn)行流式鑒定。因此，我們開發(fā)并優(yōu)化了一個(gè)14色的流式實(shí)驗(yàn)方案用于深入分析CD45.1和CD45.2的小鼠骨髓造血干細(xì)胞（HSCs），5個(gè)多能祖細(xì)胞類群（MPPs），淋系定向祖細(xì)胞類群（CLP）和8個(gè)髓系定向祖細(xì)胞類群。

在該方案中，每個(gè)細(xì)胞群都通過特異性表達(dá)的細(xì)胞表面標(biāo)記物來區(qū)分，并且使用DUMP通道將表達(dá)譜系標(biāo)記物（CD3，CD11b，B220，Gr-1，Ter119）的細(xì)胞排除。HSCs和MPPs可以通過分析細(xì)胞表面蛋白Sca-1，c-Kit，CD150，CD48，CD34和CD135來鑒定。它們被定義為：HSCs （LSK、CD150+、CD48-、CD34-、CD135-）、MPP1 （LSK、CD150+、CD48-、CD34+、CD135-）、MPP2（LSK、CD150+、CD48+、CD135-）、MPP3 （LSK、CD150-、CD48+、CD135-）、MPP4（LSK、CD150-、CD48+、CD135+）和 MPP5（LSK、CD150-、CD48-、CD135-）。

此外，髓系定向祖細(xì)胞（髓系祖細(xì)胞，CMP；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞，GMP；巨核細(xì)胞-紅細(xì)胞祖細(xì)胞，MEP；單能巨核細(xì)胞祖細(xì)胞，MkP；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞前體細(xì)胞，Pre GM；巨核細(xì)胞-紅細(xì)胞祖細(xì)胞前體細(xì)胞，Pre MegE；紅系細(xì)胞集落形成單位，CFU-E和Pre CFU-E）等由Sca-1和c-Kit加CD16/32，CD34，CD41，CD105和CD150的特異性表達(dá)鑒定：CMP（LK，CD34 +，CD16 / 32-）， GMP （LK， CD34+， CD16/32+），MEP（LK， CD34-， CD16/32-）， MkP（LK， CD150+， CD41+）， Pre GM（LK， CD150-CD105-CD41-CD16/32-），Pre MegE（LK, CD150+CD105-CD41-CD16/32-）， CFU-E（LK，CD150-CD105+CD41-CD16/32-）和Pre CFU-E （LK，CD150+CD105+CD41-CD16/32-）。然后在Sca-1和c-Kit低表達(dá)的細(xì)胞群中進(jìn)一步分析CD135和CD127以區(qū)分CLP（LSlowKlow，CD135 + CD127 +）。

14色HSPCs方案基于安捷倫 NovoCyte Quanteon 流式細(xì)胞儀所開發(fā)，Quanteon配備 4 個(gè)激光器（405 nm、488 nm、561 nm 和 637 nm）和 25 個(gè)熒光檢測器。對小鼠造血干細(xì)胞的深層次表型進(jìn)行表征，大大提高我們對HSCs、MPPs以及成熟血細(xì)胞之間關(guān)系的理解。

手動(dòng)圈門策略

首先，F(xiàn)SC-H / A，SSC-H / A和width參數(shù)用于排除細(xì)胞碎片和粘連細(xì)胞，然后圈出活細(xì)胞與Lineage-（Lineage marker包括CD3，Gr-1，CD11b，CD45R，Ter-119）的成熟造血細(xì)胞，在活細(xì)胞和Lineage-中分析CD45.1和CD45.2表達(dá)（圖2A）。隨后，在CD45.1和CD45.2細(xì)胞群中分析HSPCs各類群（圖2B，2C）。LK（Lineage-、Sca-1-、c-Kit+）、LSK（Lineage-、Sca-1+、c-Kit+）和LSlowKlow（Lineage-、Sca-1low、c-Kitlow）是根據(jù)Sca-1 和 c-Kit的表達(dá)來定義的(i)。此外，在LK細(xì)胞類群中對髓系定向祖細(xì)胞進(jìn)一步分析：CMP（LK，CD34 +，CD16 /32-），GMP（LK，CD34 +，CD16 / 32 +），MEP（LK，CD34-，CD16 / 32-），MkP（LK，CD150 +，CD41 +），Pre GM（LK，CD150-CD105-CD41-CD16 /32-），Pre MeE（LK，CD150 + CD105-CD41-CD16 / 32-），CFU-E（LK，CD150-CD105 + CD41-CD16 / 32-）和Pre CFU-E（LK，CD150 + CD105 + CD105 + CD41 - CD16 / 32-）(ii)。在LSK細(xì)胞群中進(jìn)一步分析HSCs和MPP 1-5亞群：HSCs（LSK、CD150+、CD48-、CD34-、CD135-）、MPP1（LSK、CD150+、CD48+、CD135-）、MPP2（LSK、CD150+、CD48+）、MPP3（LSK、CD150-、CD48+、CD135-）、MPP4（LSK、CD150-、CD48+、CD135+）和MPP5（LSK、CD150-、CD48-）(iii)。最后，根據(jù)CD135和CD127的表達(dá)來區(qū)分CLP細(xì)胞（LSlowKlow，CD135+，CD127+）（iv）。

圖 1. 小鼠HSPCs各類群分析的手動(dòng)圈門邏輯。（A）首先去除細(xì)胞碎片、粘連細(xì)胞、死細(xì)胞和成熟造血細(xì)胞，然后分析CD45.1和CD45.2的表達(dá)。（B. C）在隨后的分析中，以CD45.1和CD45.2細(xì)胞群的Sca-1和c-Kit的表達(dá)來定義LK和LSK細(xì)胞群以及LSlowKlow細(xì)胞群：（i）然后在LK細(xì)胞中分析CMP，GMP，MEP，Pre GM, Pre MegE, Pre CFU-E, CFU-E and MkP各細(xì)胞群。（ii）在LSK細(xì)胞群中進(jìn)一步鑒定HSC和MPP1-5細(xì)胞群。（iii）在LSlowKlow細(xì)胞群中分析CLP細(xì)胞群。

高維分析

在排除粘連細(xì)胞后圈出每群細(xì)胞，在FlowJo軟件中分別進(jìn)一步分析LK和LSK細(xì)胞群，以進(jìn)行可視化分析，如圖3所示。將除去Lineage、live/dead、CD45.1和CD45.2以外的所有細(xì)胞表面標(biāo)記物進(jìn)行t-SNE分析，之后將t-SNE圖譜分為CD45.1和CD45.2兩類。隨后，將手動(dòng)圈門的細(xì)胞群應(yīng)用于t-SNE圖上，不同細(xì)胞群顯示不同顏色，并分布在t-SNE圖中不同位置。

圖 2. 高維分析。在去除碎片，粘連體，死亡和成熟造血細(xì)胞后，分別在LK和LSK群上進(jìn)行t-SNE分析（基于除了Lineage，live/dead，CD45.1和CD45.2之外的所有參數(shù)），以深入了解該14色方案的高維數(shù)據(jù)的復(fù)雜性。（A）t-SNE分析在LK細(xì)胞群中區(qū)分出了不同的髓系定向祖細(xì)胞群體將如圖2所示的各種髓系定向祖細(xì)胞類群疊加到 t-SNE 圖上（i-vi），t-SNE圖顯示了各種髓系定向祖細(xì)胞在總LK（i，iv），CD45.1+ LK（ii，v）和CD45.2+ LK（iii，vi）中的分布。（B）t-SNE分析將LSK細(xì)胞群中不同的MPPs以及HSCs細(xì)胞群區(qū)分開。將如圖2所示的不同MPPs和HSCs細(xì)胞群疊加到t-SNE圖上，t-SNE 圖顯示了他們在總LSK （vii）、CD45.1+ LSK （viii）和 CD45.2+ LSK （ix）的分布情況。

FMO對照

熒光減一對照（FMO）用于評估所有細(xì)胞表面標(biāo)記物的區(qū)分。結(jié)果如圖3所示，確認(rèn)了真正的陰性界限并進(jìn)一步驗(yàn)證了熒光的擴(kuò)散不影響門控，并且所有細(xì)胞表面標(biāo)記物沒有發(fā)生分辨率損失。

圖 3. 利用FMO對照來驗(yàn)證門控。通過FMO對照來確定除live/dead和Lineage之外的所有表面標(biāo)記物的背景染色來驗(yàn)證門控，其中FMO對照是除待分析的抗體外染色其他所有抗體。顯示的是完全染色的樣品和相應(yīng)的FMO的圖。FMO 對照的圈門與圖 1 一致。

結(jié)論

多色流式細(xì)胞術(shù)已成為免疫學(xué)研究的重要工具。該14色方案可用于小鼠造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的更深層次的表型表征，并大大提高我們對HSCs、MPPs和成熟血細(xì)胞之間關(guān)系的理解。我們的結(jié)果表明，使用安捷倫 NovoCyte Quanteon 流式細(xì)胞儀可以更好地檢測低表達(dá)的抗原，為我們了解小鼠造血系統(tǒng)提供了更深度的分析方案。

?參考文獻(xiàn)

[1] Eich M, Trumpp A, Schmitt S. OMIP-059: Identification of mouse hematopoietic stem and progenitor cells with simultaneous detection of CD45.1/2 and controllable green fluorescent protein expression by a single staining panel. Cytometry A. 2019 Oct;95(10):1049-1052.

[2] Solomon M, DeLay M, Reynaud D. Phenotypic Analysis of the Mouse Hematopoietic Hierarchy Using Spectral Cytometry: From Stem Cell Subsets to Early Progenitor Compartment. Cytometry A. 2020 Oct;97(10):1057-1065.

關(guān)于安捷倫

安捷倫科技有限公司（紐約證交所：A）是生命科學(xué)、診斷和應(yīng)用化學(xué)市場領(lǐng)域的全球領(lǐng)導(dǎo)者，致力于為提高生活質(zhì)量提供敏銳洞察和創(chuàng)新經(jīng)驗(yàn)。安捷倫的儀器、軟件、服務(wù)、解決方案和專家能夠?yàn)榭蛻糇罹咛魬?zhàn)性的難題提供更可靠的答案。2021財(cái)年，安捷倫營業(yè)收入為63.2億美元，全球員工數(shù)約為17,000人。

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