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干貨 | 高分轉(zhuǎn)錄組+代謝組需要哪些基因功能研究？

邁維代謝

2022.10.18

高分的轉(zhuǎn)錄組+代謝組文章，除了分析思路新穎，可以找到關(guān)鍵的新基因或新的轉(zhuǎn)錄因子之外，找到基因之后，有沒有系統(tǒng)的，全面的基因功能驗證方案也是決定文章影響因子好壞的重要指標(biāo)。

那么基因驗證工作有很多，如何根據(jù)不同的目的去篩選不同的驗證方法呢。我們先來看下基因驗證有哪些分類：

?? 第一類，基因表達量的驗證。候選基因表達量的驗證，目的是確定該基因在特定組織（細胞）中的表達量與對照組織（細胞）有差異。

???第二類，基因位置定位。確定基因的位置，是核基因還是膜基因或者細胞器基因等。

???第三類，候選基因功能驗證。將基因進行敲除（敲低）、過表達，或進行功能回復(fù)實驗，確定該基因的差異表達與生理或病理狀態(tài)相關(guān)。

???第四類：基因調(diào)控機制驗證。互作驗證，研究 RNA與RNA或RNA與蛋白之間如何作用、調(diào)控，最終導(dǎo)致功能改變。

定性定量驗證

1.熒光定量核酸擴增檢測（Real-time Quantitative PCR Detecting System，qPCR）

qPCR技術(shù)是目前最為常見而且必須的高通量測序的驗證方法。目前廣泛用于轉(zhuǎn)錄組測序后的候選基因的定性定量研究。轉(zhuǎn)錄組測序作為最常見的二代測序技術(shù)[1]，進行定性定量研究時依靠生物信息分析計算出多基因的表達量，會存在一定的誤差，而qPCR是檢測特定基因表達豐度，特異性更高。

qPCR驗證流程：

基因位置定位

亞細胞定位是查找基因或蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的具體存在的位置，如在核內(nèi)、胞質(zhì)內(nèi)或者細胞膜上存在。常見的亞細胞定位方法有生物信息學(xué)預(yù)測法、免疫熒光法、GFP融合蛋白表達法。

1.免疫熒光法

免疫熒光法（Immunofluorescence method）是將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來研究特異蛋白抗原在細胞內(nèi)分布的方法。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，從而可對抗原進行細胞定位。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細胞(或組織)化學(xué)技術(shù)。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在細胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色)，可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位。

圖1.免疫熒光原理示意圖

2.GFP融合蛋白表達法

GFP是綠色熒光蛋白，在掃描共聚焦顯微鏡的激光照射下會發(fā)出綠色熒光，從而可以精確地定位蛋白質(zhì)的位置。綠色螢光蛋白（GFP）是一個由約238個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，從藍光到紫外線都能使其激發(fā)，發(fā)出綠色熒光。通過基因工程技術(shù)，綠色螢光蛋白(GFP)基因能轉(zhuǎn)進不同物種的基因組，在后代中持續(xù)表達，并且能根據(jù)啟動子特異性地表達。使用GFP必須構(gòu)建融合蛋白載體，并在轉(zhuǎn)染之后有效表達。這樣，若在熒光顯微鏡下看到細胞內(nèi)某一部位存在GFP信號，說明和GFP融合的蛋白也存在于該部位，這樣就達到了確定某物質(zhì)亞細胞定位的目的。

GFP融合蛋白表達實驗流程：

圖2.GFP融合蛋白亞細胞定位結(jié)果展示

功能驗證

1.基因過表達驗證

通過人工構(gòu)建的方式在目的基因上游加入調(diào)控元件，使基因可以在人為控制的條件下實現(xiàn)大量轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而實現(xiàn)基因產(chǎn)物的過表達。

應(yīng)用：mRNA，lncRNA，miRNA等功能驗證。

驗證流程：

2.基因功能缺失(Loss of function)研究

包括敲除（knock out）、RNAi技術(shù)和基因編輯技術(shù)，敲除（敲低）目的基因。使用RNA干擾（RNAi）、CRISPR/Cas9、T-DNA插入等方法敲除（敲低）目的基因，同時觀察表型和功能變化。

1）RNAi方法

dsRNA進入胞質(zhì)后，核酸內(nèi)切酶Dicer將dsRNA切割成多個小RNA（大約21～23 bp），即siRNA。siRNA在細胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈，由反義siRNA再與體內(nèi)一些酶（包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等）結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-inducedsilencing complex，RISC)。RISC具有核酸酶的功能，與mRNA進行特異性結(jié)合并切割mRNA。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細胞針對這些mRNA的降解反應(yīng)。另，shRNA（shorthairpin RNA，短發(fā)夾RNA）可被加工為siRNA，還存在另外一種小分子RNA（microRNA，miRNA）也能引起RNAi現(xiàn)象。

驗證流程：

CRISPR/Cas（Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats）CRISPR/Cas是細菌和古細菌為應(yīng)對病毒和質(zhì)粒不斷攻擊而演化來的獲得性免疫防御機制，其主要功能是對抗入侵的病毒及外源DNA。在這一系統(tǒng)中，crRNA（CRISPR-derived RNA）通過堿基配對與tracrRNA（trans-activating RNA）結(jié)合形成雙鏈RNA，此tracrRNA/crRNA二元復(fù)合體指導(dǎo)Cas9蛋白在crRNA引導(dǎo)序列的靶定位點剪切雙鏈DNA，從而達到對基因組DNA進行修飾的目的。

3.回復(fù)實驗

過表達的同時敲除（敲低）目的基因，或者是在敲除（敲低）的基礎(chǔ)上過表達目的基因，觀察表型和功能是否回復(fù)。

圖3.回復(fù)實驗結(jié)果展示

4.酶活驗證

通過將目的基因轉(zhuǎn)入載體，誘導(dǎo)其表達獲得有功能活性的蛋白，并構(gòu)建含有該蛋白和底物的反應(yīng)體系進行反應(yīng)，以驗證蛋白是否具有催化作用。體外酶活驗證通常用來幫助鑒定基因/蛋白功能、專一性等，也可幫助構(gòu)建代謝通路。在轉(zhuǎn)錄組+代謝組發(fā)現(xiàn)候選基因與代謝物后，可選擇酶活驗證方法，來驗證候選代謝物是否為后續(xù)基因的底物，及是否可以生成預(yù)期代謝產(chǎn)物。

酶活驗證流程：

相互作用的研究方法

相互作用研究和驗證包括CoIP、ChIP、RIP、RNAFISH、EMSA，酵母單雜，雙熒光素報告酶系統(tǒng)檢測等。可以驗證RNA與蛋白，及轉(zhuǎn)錄因子與基因啟動子的相互作用關(guān)系。

1.雙熒光素酶報告系統(tǒng)

熒光素酶報告基因是指以熒光素(luciferin)為底物來檢測螢火蟲熒光素酶(fireflyluciferase) 活性的一種報告系統(tǒng)。熒光素酶可以催化熒光素氧化成氧化熒光素，在熒光n氧化的過程中，會發(fā)出生物熒光(bioluminescence)。然后可以通過熒光測定儀也稱化學(xué)發(fā)光儀或液閃測定儀測定熒光素氧化過程中釋放的生物熒光。熒光素和熒光素酶這一生物發(fā)光體系，可以極其靈敏、高效地檢測基因的表達。是檢測轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動子區(qū)DNA相互作用的一種檢測方法。

雙熒光素酶實驗流程：

2.RNA pull-down

RNA pull-down是檢測RNA結(jié)合蛋白與其靶RNA之間相互作用的主要實驗手段之一。使用體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記生物素RNA探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其他成分分離。復(fù)合物洗脫后，通過western blot實驗檢測特定的RNA結(jié)合蛋白是否與RNA相互作用或質(zhì)譜實驗檢測特定的RNA結(jié)合蛋白的蛋白類型?？捎糜谘芯縇ncRNA或CircRNA與蛋白的互作。

3.RIP

免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是研究蛋白與其他大分子互作的關(guān)鍵技術(shù)之一，研究蛋白與蛋白互作稱為Co-IP，蛋白與RNA互作稱為RIP，蛋白與DNA互作稱為ChIP?；驹硎菍⒀芯磕康牡鞍椎目贵w進行免疫共沉淀，接下來根據(jù)要檢測的分子類型通過各種方法進行檢測。

RIP（RNA Binding Protein Immunoprecipitation）主要側(cè)重于蛋白質(zhì)- RNA相互作用。主要是運用針對目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來，經(jīng)過分離純化就可以對結(jié)合在復(fù)合物上的RNA 進行q-PCR驗證或者測序分析。

RNA pull-down和RIP一個側(cè)重于驗證蛋白質(zhì)，一個側(cè)重于驗證RNA，兩者的結(jié)果可以相互印證。

圖4.RNA pull down（左）與 RIP-PCR（右）原理示意圖

4.凝膠遷移或電泳遷移率實驗（EMSA）

是檢測蛋白質(zhì)和核酸序列（DNA或RNA）相互結(jié)合的技術(shù)。蛋白與 DNA（RNA）結(jié)合形成的復(fù)合物由于分子量大，在電泳過程中遷移較慢，出現(xiàn)不同位置的條帶。

圖5.EMSA實驗結(jié)果圖

5.酵母單雜交系統(tǒng)

酵母單雜交(Yeast one-hybrid)是根據(jù)DNA結(jié)合蛋白(即轉(zhuǎn)錄因子)與DNA順式作用元件結(jié)合，調(diào)控報道基因表達的原理克隆與靶元件特異結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子基因(cDNA)的有效方法。其理論基礎(chǔ)是:許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活子由物理和功能上獨立的DNA結(jié)合區(qū)(DNA-binding domain BD)和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(Activation domain AD)組成，因此可構(gòu)建各種基因與AD的融合表達載體，在酵母中表達為融合蛋白時，根據(jù)報道基因的表達情況，便能篩選出與靶元件有特異結(jié)合區(qū)域的蛋白。理論上，在單雜交檢測中，任何靶元件都可被用于篩選一種與之有特異結(jié)合區(qū)域的蛋白。由于酵母單雜交方法檢測特定轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件專一性相互作用的敏感性和可靠性，現(xiàn)已被廣泛用于克隆細胞中含量微弱的、用生化手段難以純化的特定轉(zhuǎn)錄因子。

圖5.酵母單雜流程圖

6.酵母雙雜交系統(tǒng)的原理

酵母雙雜交系統(tǒng)是將待研究的兩種蛋白質(zhì)的基因分別克隆到酵母表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄激活因子（如GAL4等）的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域基因和轉(zhuǎn)錄激活因子（如GAL4等）激活結(jié)構(gòu)域基因，構(gòu)建成融合表達載體，從表達產(chǎn)物分析兩種蛋白質(zhì)相互作用的系統(tǒng)。由于蛋白質(zhì)直接互作是蛋白質(zhì)發(fā)揮調(diào)控作用的重要方式，如果要研究某個基因行駛某功能，可以將這個基因和靶基因都整合到酵母中進行互作研究，從而分析其功能。

圖6.酵母雙雜交原理示意圖

參考文獻：

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