Advanced Science：南京大學(xué)王守宇等團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)胃癌潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物和化療耐藥治療靶點

吉凱基因

2022.9.19

胃癌（GC）是全球第五大最常見的惡性腫瘤和第三大癌癥相關(guān)死亡原因，每年約有40%的新病例和死亡發(fā)生在中國。化療是晚期胃癌患者的首選治療策略。然而，耐藥性和不可避免的嚴(yán)重毒副作用會導(dǎo)致化療失敗，預(yù)后不良。長鏈非編碼 RNA (lncRNA) 在包括 GC 在內(nèi)的多種癌癥進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。

南京大學(xué)王守宇教授、孫倍成教授、中國藥科大學(xué)莫然教授及中國科學(xué)院生物物理研究所薛愿超教授共同通訊在Advanced Science (IF=17.521)發(fā)表題為“APAF1-Binding Long Noncoding RNA Promotes Tumor Growth and Multidrug Resistance in Gastric Cancer by Blocking Apoptosome Assembly”的文章。

本文通過高通量篩選發(fā)現(xiàn)一種與凋亡蛋白酶激活因子1(APAF1)結(jié)合的 lncRNA (ABL)，ABL在GC組織中顯著升高，并可以作為GC患者的獨立預(yù)后因素。此外，ABL可以抑制GC細(xì)胞凋亡并促進(jìn)GC細(xì)胞異種移植和類器官模型中的細(xì)胞存活和多藥耐藥。機(jī)制上，ABL通過直接與RNA結(jié)合蛋白IGF2BP1結(jié)合識別 METTL3介導(dǎo)的 ABL上的 m6A 修飾，維持ABL穩(wěn)定性。同時，ABL可以與 APAF1的 WD1/WD2結(jié)構(gòu)域結(jié)合，競爭性地阻止細(xì)胞色素C（Cyt c）與APAF1相互作用，阻斷凋亡小體組裝和 Caspase-9/3激活，最終導(dǎo)致GC細(xì)胞對化療藥物的多藥耐藥。總的來說，該研究結(jié)果表明 ABL可以作為 GC潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點。

研究思路及方法

1. ABL表達(dá)升高與GC患者預(yù)后不良相關(guān)

作者首先以4例胃癌病人癌和癌旁組織進(jìn)行l(wèi)ncRNAs表達(dá)譜的分析結(jié)合RNAscope、FISH染色等多個實驗方法發(fā)現(xiàn)ABL的表達(dá)在GC組織中升高，且與 GC患者預(yù)后不良相關(guān)。

2. ABL直接與APAF1結(jié)合

隨后，作者通過RNA Pull-down結(jié)合質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)ABL與凋亡蛋白酶激活因子1 (APAF1)結(jié)合。接著作者利用ABL antisense 探針進(jìn)行dot blot實驗，發(fā)現(xiàn) ABL 在 481-540bp處與 APAF1結(jié)合；利用 RNA Pull-down 實驗發(fā)現(xiàn) ABL與APAF1 的WD1/WD2結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合。同時，LACE-seq實驗證實APAF1可以與ABL結(jié)合。

3.抑制ABL表達(dá)促進(jìn)GC細(xì)胞凋亡并增加GC細(xì)胞對化療藥物的敏感性

之后作者分別用不同濃度的順鉑（DDP）、5-氟尿嘧啶（5-FU）及紫杉醇（PTX）三種不同化療藥物處理ABL 穩(wěn)定過表達(dá)/低表達(dá)的胃癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn) ABL可以拮抗多種化療藥物的作用。

4. ABL通過競爭性阻斷APAF1與Cyt c的結(jié)合來拮抗GC細(xì)胞凋亡

接著，作者通過 western blot、IF、流式、TUNEL等實驗證實在外界凋亡信號如 DDP 等化療藥物刺激下， ABL可以競爭性結(jié)合APAF1，抑制Cyt c與 APAF1結(jié)合形成凋亡復(fù)合體，從而不能激活Caspase 9 形成 Caspase 9剪切體，減輕了Caspase級聯(lián)反應(yīng)，抑制Caspase 3的剪切，最終拮抗了DDP等藥物誘導(dǎo)的GC細(xì)胞損傷及細(xì)胞凋亡。

5. ABL促進(jìn)體內(nèi)GC細(xì)胞生長和多藥耐藥

隨后，作者利用DDP及PTX處理ABL穩(wěn)定過表達(dá)的胃癌類器官，發(fā)現(xiàn)ABL可以拮抗DDP等化療藥物誘導(dǎo)的類器官細(xì)胞損傷及細(xì)胞凋亡。此外，小鼠體內(nèi)成瘤實驗也證實ABL促進(jìn)體內(nèi)GC細(xì)胞的生長和順鉑耐藥。

6. IGF2BP1結(jié)合并識別ABL上m6A修飾而保持 ABL的穩(wěn)定性

之后，作者通過多種實驗方法證實 ABL 在 121–180bp處與 IGF2BP1結(jié)合；利用 RNA Pull-down 實驗發(fā)現(xiàn) ABL與IGF2BP1的 KH1/KH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合。過表達(dá) RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶METTL3，則會增加ABL的m6A修飾，促進(jìn)ABL的穩(wěn)定。接著，作者通過雙熒光素酶報告基因證實 IGF2BP1可以識別ABL（121–180bp）上的m6A修飾。總的來說，IGF2BP1結(jié)合并識別 ABL上 METTL3介導(dǎo)的 m6A修飾而維持ABL的穩(wěn)定性。

7. ABL增強(qiáng)化療藥物對胃癌細(xì)胞的敏感性

最后，作者探索發(fā)現(xiàn)了一種新的靶向ABL的治療策略，使用納米材料共組裝ABL siRNA和PTX，可以顯著增強(qiáng)PTX在體內(nèi)對GC細(xì)胞的殺傷作用，促進(jìn) PTX的抗腫瘤作用。

研究總結(jié)

該研究中鑒定了一個結(jié)APAF1的lncRNA (ABL，也稱為 RP3-512B11.3) 并揭示了其在GC中的生物學(xué)功能。作者發(fā)現(xiàn) IGF2BP1 直接結(jié)合并識別了 METTL3 介導(dǎo)的ABL上的m6A修飾從而維持 ABL穩(wěn)定性，導(dǎo)致ABL表達(dá)上調(diào)。豐富的ABL可以通過直接與APAF1結(jié)合，競爭性阻斷 APAF1與 Cyt c的相互作用，從而阻斷凋亡小體的組裝和Caspase-9/3 的激活，最終導(dǎo)致GC細(xì)胞對化療藥物的多藥耐藥?？偟膩碚f，該研究結(jié)果表明 ABL可以作為 GC潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點。

注：METTL3過表達(dá)慢病毒來自于吉凱基因。