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項(xiàng)目文章 | 代謝組助力中成藥成分分析＆藥效機(jī)理解析

邁維代謝

2022.8.25

結(jié)合代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究清熱卡森顆粒治療腎病綜合征的作用機(jī)制

期刊：Frontiers in Pharmacology

IF: 5.810

發(fā)表時(shí)間：2021年12月

單位：湖北中醫(yī)藥大學(xué)

研究背景

2021年12月，湖北中醫(yī)藥大學(xué)李晶晶，韓林濤老師團(tuán)隊(duì)，一作段艷芬在Frontiers in Pharmacology發(fā)表了題為“Integrated metabolomics and network pharmacology to establish the action mechanism of qingrekasen granule for treating nephrotic syndrome”的研究論文。本研究綜合代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討了清熱卡森顆粒治療腎病綜合征的作用機(jī)制。邁維代謝為本研究提供了次生代謝組檢測(cè)分析服務(wù)。

腎病綜合征（NS）是由腎小球通透性異常引起的臨床綜合征，主要表現(xiàn)為水腫和蛋白尿。清熱卡森顆粒（QRKSG）是中國(guó)維吾爾族民間藥物，是由菊苣（Cichorium intybus L.）制成的單味制劑，廣泛用于治療排尿困難和水腫。菊苣是QRKSG的主要成分，能夠有效治療水腫和保護(hù)腎臟。然而QRKSG中的活性成分及其治療NS的潛在機(jī)制仍不清楚。

技術(shù)路線：

實(shí)驗(yàn)處理：對(duì)照組，模型組，治療組（QRKSG組，貝那普利組）

實(shí)驗(yàn)樣本：尿液以及血液（生理指標(biāo)檢測(cè)），腎臟（組織病理學(xué)觀察，GC-MS檢測(cè)），QRKSG顆粒（LC-MS/MS次生代謝物檢測(cè)）

研究結(jié)果

血清生化指標(biāo)和尿蛋白定量分析

與對(duì)照相比，模型組血清中TG、BUN、TC、Cr水平升高，ALB、TP下降，然而，QRKSG治療后降低了血清中 TG、BUN、TC 和 Cr 的水平，ALB 和 TP 的水平升高（圖1）。大鼠24 h尿蛋白評(píng)估顯示，模型建立后第1-4周，尿蛋白逐漸增加（圖2）。與模型組相比，QRKSG和貝那普利組在第1周的蛋白尿含量沒(méi)有顯著差異，但在第3、4周時(shí)，模型組的尿蛋白含量明顯高于QRKSG組(p<0.001)。此外，在第4周，QRKSG組的尿蛋白水平高于貝那普利組。然而，與對(duì)照組相比，QRKSG和貝那普利組的尿蛋白水平降低。

圖1 血清生化指標(biāo)變化。(A) 血清Cr水平 (B)血清ALB水平 (C)血清BUN水平 (D)血清TG水平 (E)血清TC水平 (F)血清TP水平

圖2 ?1-4周大鼠24h尿蛋白含量變化

組織病理學(xué)分析

作者利用光鏡觀察了腎組織病理變化，結(jié)果顯示，對(duì)照組腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)明顯損傷。而模型組中腎小管異常、管腔擴(kuò)張和水腫，與模型組相比，貝那普利和QRKSG組水腫及形態(tài)學(xué)改變明顯減輕（圖3）。透射電鏡結(jié)果顯示，正常組足突排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，基底膜厚度均勻。模型組足突有大量彌漫性融合，足細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。此外，QRKSG和貝那普利組的融合程度顯著降低，可見(jiàn)一些正常的足細(xì)胞（圖 4）。組織學(xué)評(píng)估證實(shí)，QRKSG減輕了ADR誘導(dǎo)的NS對(duì)大鼠腎臟引起的病理?yè)p傷。

圖3 各組組織病理學(xué)顯微照片(×200)。(A)對(duì)照組；(B)模型組；(C)貝那普利組；(D) QRKSG組

圖 4 電鏡下各組腎小球足細(xì)胞改變(放大×8,000)。(A)對(duì)照組；(B)模型組；(C)貝那普利組；(D) QRKSG組

QRKSG 對(duì)腎臟代謝的影響

作者對(duì)對(duì)照組、模型組、貝那普利組、QRKSG組腎臟樣品進(jìn)行GC-MS分析，PCA結(jié)果顯示，模型組和QRKSG組出現(xiàn)明顯分離（圖5C），PLS-DA R2 (=0.963) 和Q2 (=0.885) 表明該模型具有良好的判別和預(yù)測(cè)能力（圖5D），腎代謝譜PCA和PLS-DA分析顯示，QRKSG組和貝那普利組的代謝介于模型組和對(duì)照組之間，這些結(jié)果表明QRKSG治療能夠使大鼠腎臟代謝物水平恢復(fù)正常（圖 5A、B）。

圖 5 QRKSG對(duì)NS大鼠的干預(yù)作用。(A) PCA評(píng)分圖；(B) PLS-DA評(píng)分圖；(C)模型與QRKSG組的主成分分析；(D)模型與QRKSG組的PLS-DA分析；(E)大鼠腎臟24種潛在代謝物的熱圖可視化；(F)通路分析

代謝途徑分析

24個(gè)代謝物被鑒定為QRKSG治療NS中潛在的生物標(biāo)志物（p1）。QRKSG組24個(gè)代謝產(chǎn)物中有15個(gè)上調(diào)，9個(gè)下調(diào)。熱圖結(jié)果顯示，QRKSG和貝那普利組中代謝物發(fā)生了顯著變化（圖5E）。使用MetaboAnalyst5.0進(jìn)行差異代謝途徑分析，篩選影響值> 0.1作為潛在相關(guān)代謝途徑。所鑒定出的潛在生物標(biāo)志物主要涉及氨基酸代謝的四種途徑：D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝；精氨酸和脯氨酸代謝；以及精氨酸生物合成（圖 5F）

QRKSG成分分析

作者使用UPLC-MS/MS進(jìn)行的成分分析，總共鑒定出411種化合物，其中黃酮類化合物142個(gè)，酚酸類化合物149個(gè)，萜類化合物16個(gè)，生物堿類化合物29個(gè)，木酚素類化合物27個(gè)，香豆素類化合物3個(gè)，其他化合物45個(gè)。分析發(fā)現(xiàn)，QRKSG組中洋薊素、槲皮素-4-O-葡萄糖醛酸、七葉苷和菊苣苷的含量最高。

表1?QRKSG中30種化合物的LC-MS/MS信息

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

作者綜合SwissTargetPrediction 、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)獲得相關(guān)靶標(biāo)基因，利用DAVID 進(jìn)行GO,KEGG富集分析。GO功能富集產(chǎn)生了2502個(gè)GO富集條目，包括 2,257（90.2%）個(gè)BP（生物過(guò)程）、75（3.3%）個(gè) CC（細(xì)胞成分）和 170（6.8%）個(gè) MF（分子功能），圖中展示了富集前20的條目（圖6A），KEGG富集前20的通路主要包括PI3K-Akt信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路以及EGFR酪氨酸激酶抑制劑抗性（圖6B），PI3K-Akt信號(hào)通路有35個(gè)靶點(diǎn)，包括AKT1、BCL2L1、mTOR、STAT3、EGFR和HSP90AA1。糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路有22個(gè)靶點(diǎn)，包括CASP3、AKT1、TNF、MMP2和MAPK1。

圖 6 富集前20的GO條目（A）和KEGG通路（B）

代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

作者使用Cytoscape3.8.0構(gòu)建代謝物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示34個(gè)節(jié)點(diǎn)相互作用（6個(gè)途徑、5個(gè)代謝物、15個(gè)酶和8個(gè)靶點(diǎn)）（圖7）。其中AKT1、BCL2L1和mTOR參與PI3K-Akt信號(hào)通路，對(duì)ADR誘導(dǎo)的足細(xì)胞肝損傷具有保護(hù)作用。凋亡相關(guān)蛋白CASP3、BCL2L1等也與腎小管細(xì)胞凋亡有關(guān)。因此，AKT1、BCL2L1、CASP3、mTOR是QRKSG治療NS的核心靶點(diǎn)。此外，在網(wǎng)絡(luò)圖中，L-谷氨酸和鳥(niǎo)氨酸調(diào)節(jié)多個(gè)靶點(diǎn)，說(shuō)明QRKSG通過(guò)多個(gè)靶點(diǎn)和代謝物調(diào)節(jié)多個(gè)代謝通路發(fā)揮治療作用。

圖 7 代謝物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

分子對(duì)接

作者首先對(duì)對(duì)接方法進(jìn)行驗(yàn)證，AKT1、CASP3、BCL2L1 和 mTOR 的晶體分別含有原始配體，包括OR4 (AKT1)、TQ8 (CASP3)、H0Y (BCL2L1)和RAP (mTOR)。對(duì)接結(jié)果(圖8B-E，藍(lán)色配體)與實(shí)際結(jié)果幾乎相同(圖8B-E，紅色配體)，對(duì)接和原始配體構(gòu)象的均方根誤差 (RMSD) 分別為 0.7740、1.6423、0.3114 和 0.5901。這些RMSD小于2.0 ?，表明對(duì)接可行、有效。本研究通過(guò)分子對(duì)接驗(yàn)證了QRKSG活性化合物顯著調(diào)控AKT1、CASP3、BCL2L1和mTOR。結(jié)果表明，AKT1、CASP3和mTOR對(duì)大多數(shù)化合物有很強(qiáng)的親和力，包括黃酮類化合物、萜類化合物和酚酸?；衔锱c靶標(biāo)之間的絕對(duì)結(jié)合能值超過(guò)4.25 (圖 8A），受力分析確定萵苣苦素通過(guò)5種氨基酸：ASN59、VAL-270、GLN-79、TRP-80、SER-205與AKT1結(jié)合(圖8F)，通過(guò)3種氨基酸：ARG-139、PHE-105、TYR-101與BCL2L1結(jié)合（(圖8G)）。對(duì)于CASP3，萵苣苦素通過(guò)6個(gè)氨基酸：THR-204、GLY-122、THR-166、HIS-121、MET-61、THR-62與AKT1結(jié)合(圖10H)，而對(duì)于mTOR，通過(guò)5個(gè)氨基酸與之結(jié)合：GLU-2032、SER-2035、PHE-2108、TYR-2105、GLN-85(圖8I)。

圖 8 分子對(duì)接結(jié)果。（A）活性組分和目標(biāo)之間的結(jié)合能；(B) AKTI對(duì)接的驗(yàn)證；(C) BCL2L1對(duì)接結(jié)果的驗(yàn)證；(D) CASP3對(duì)接結(jié)果的驗(yàn)證；(E) mTOR對(duì)接結(jié)果的驗(yàn)證；(F)萵苣苦素與AKT1形成的穩(wěn)定復(fù)合物；(G) 萵苣苦素與BCL2L1形成的穩(wěn)定復(fù)合物；(H) 萵苣苦素與CASP3形成的穩(wěn)定復(fù)合物；(I) 萵苣苦素與mTOR形成的穩(wěn)定復(fù)合物

蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果分析

作者通過(guò)分析p-PI3K、PI3K、p-AKT1、AKT1、p-mTOR、mTOR、BCL-2、CASP3蛋白表達(dá)，揭示QRKSG介導(dǎo)NS大鼠自噬和抑制凋亡的可能機(jī)制。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型中p-PI3K、p-AKT1、p-mTOR和CASP3升高，而B(niǎo)CL-2降低（圖9A）。與模型組比較，QRKSG中p-PI3K、p-AKT1、p-mTOR、CASP3表達(dá)減少，BCL2L1表達(dá)增加（p<0.05）。與對(duì)照組相比，模型中p-PI3K、p-AKT1、p-mTOR、CASP3表達(dá)明顯升高，BCL-2表達(dá)明顯降低（p<0.05）（圖9B）。

圖 9 PI3K、AKT1、mTOR、BCL-2和CASP3 Western blot分析。(A) PI3K，AKT1，mTOR，BCL-2，CASP3的代表性圖像；(B) PI3K、AKT1和mTOR蛋白表達(dá)；(C) BCL-2和CASP3蛋白表達(dá)。

邁維小結(jié)

研究目的：探究清熱卡森顆粒治療腎病綜合征的作用機(jī)制

研究結(jié)論：該文綜合代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究了清熱卡森顆粒治療腎病綜合征的作用機(jī)制，揭示了與5種代謝產(chǎn)物和6種途徑有關(guān)的23個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。這些潛在靶點(diǎn)與多種QRKSG活性成分有關(guān)。在關(guān)鍵靶點(diǎn)中，AKT1、MTOR、CASP3 和 BCL2L1對(duì)QRKSG治療NS的潛在機(jī)制很重要。具體而言，QRKSG的潛在機(jī)制包括抑制細(xì)胞凋亡、增加細(xì)胞自噬、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝、減少蛋白尿和減輕腎臟損傷。因此，這些關(guān)于QRKSG潛在機(jī)制的發(fā)現(xiàn)為QRKSG臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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