單B細(xì)胞抗體技術(shù)的關(guān)鍵步驟

丹納赫生命科學(xué)

2022.8.12

單個(gè)B細(xì)胞抗體技術(shù)作為新一代抗體開發(fā)技術(shù)，可以從單個(gè)B細(xì)胞中高效、快速的分離抗體，是繼雜交瘤、噬菌體展示后又一抗體產(chǎn)生技術(shù)的突破。它是根據(jù)每一個(gè)B細(xì)胞只含有一個(gè)功能性重鏈可變區(qū)DNA序列和一個(gè)輕鏈可變區(qū)DNA序列，以及每一個(gè)B細(xì)胞只產(chǎn)生一種特異性抗體的特性，從免疫動(dòng)物組織或外周血中分離抗原特異性B細(xì)胞，通過(guò)單細(xì)胞PCR技術(shù)從單個(gè)抗體分泌B細(xì)胞中擴(kuò)增IgG重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，然后在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)獲得具有生物活性的單克隆抗體。

這種技術(shù)的特點(diǎn)，是“從打過(guò)勝仗的老兵身上找武器”。一是省去了先用抗原免疫小鼠這一步，二是不再依賴必須與骨髓瘤雜交的小鼠B細(xì)胞。有了這一段基因，無(wú)論插到什么細(xì)胞都可以培養(yǎng)并量產(chǎn)，其效果類似大腸桿菌生產(chǎn)基因重組人胰島素。

典型的單個(gè)B細(xì)胞技術(shù)流程

它的主要流程為先從免疫動(dòng)物或人的身上獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞，再進(jìn)行抗原特異性結(jié)合B細(xì)胞的分選，接著通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)得到單個(gè)B細(xì)胞抗體可變區(qū)基因，再通過(guò)載體構(gòu)建獲得抗體表達(dá)，最后進(jìn)行產(chǎn)物驗(yàn)證。在此過(guò)程中，單個(gè)B細(xì)胞的分離是單B細(xì)胞技術(shù)最關(guān)鍵的步驟。目前有多種基于單細(xì)胞分離的技術(shù)，如磁珠分選法、微雕刻和ISAAC方法，流式分選法及微流控分選法等。

流式分選法是目前單B細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用較廣泛的一種，它是基于抗原抗體的特異性反應(yīng)，利用熒光素標(biāo)記的B細(xì)胞表面分子的抗體以及標(biāo)記的特異性抗原，通過(guò)多色流式分析與分選，篩選抗原特異性B細(xì)胞。流式分選可以直接將單個(gè)抗原特異性B細(xì)胞分選入細(xì)胞培養(yǎng)板的單孔中，進(jìn)行后續(xù)的抗體基因擴(kuò)增與測(cè)定。該技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：分離B細(xì)胞快速、準(zhǔn)確、大量、多參數(shù)同時(shí)分析。

丹納赫生命科學(xué)旗下貝克曼庫(kù)爾特的CytoFLEX SRT分選型流式細(xì)胞儀是新一代的高效細(xì)胞分選平臺(tái)，適用于多色免疫分型，可進(jìn)行穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞系的開發(fā)、單細(xì)胞測(cè)序應(yīng)用等。CytoFLEX SRT流式細(xì)胞分選儀提供七種不同檢測(cè)器配置，多達(dá) 15 種熒光顏色用于區(qū)分細(xì)胞群，能夠區(qū)分細(xì)胞間的細(xì)微差異，多色應(yīng)用超高靈敏度提高篩選精度；擁有4 路分選模式、混合分選模式、復(fù)雜分選邏輯等分選方式，能夠捕捉其他分選液流中丟棄的細(xì)胞，并保存寶貴細(xì)胞。

貝克曼庫(kù)爾特CytoFLEX SRT流式細(xì)胞分選儀

CytoFLEX SRT流式細(xì)胞分選儀使用垂直分選模式（Straight Down Mode），利用無(wú)電垂直向下的液流，而不是加載電荷的偏轉(zhuǎn)液流。在進(jìn)行單細(xì)胞索引分選時(shí)，使用這種模式可以在精確分選單細(xì)胞的同時(shí)獲得更好地分選后活率。

貝克曼庫(kù)爾特VICELL-XR評(píng)估

EL4小鼠T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的培養(yǎng)后活率

CytoFLEX SRT配套的數(shù)據(jù)獲取和分析軟件界面直觀，方便多色分析；采用創(chuàng)新的設(shè)置、監(jiān)測(cè)和液流維持系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)工作流自動(dòng)化，節(jié)省研發(fā)者大量時(shí)間和精力。

CytEXPERT SRT軟件界面

此外，美谷分子儀器的CloneSelect 高通量單細(xì)胞分離系統(tǒng)，基于微流控分離技術(shù)，使用專有的噴墨式一次性單向分離槽，可以輕柔而高效地分離單個(gè)細(xì)胞。該系統(tǒng)擁有高分辨率的明場(chǎng)和熒光成像，可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選圖像采集，獲得單克隆的圖像證據(jù)，具有潛在的單個(gè)B細(xì)胞分離的應(yīng)用價(jià)值。

CloneSelect 高通量單細(xì)胞分離系統(tǒng)

? ? ?單細(xì)胞分選過(guò)程圖像記錄

通過(guò)單細(xì)胞分離技術(shù)獲得的單個(gè)特異性B細(xì)胞，經(jīng)過(guò)單細(xì)胞PCR技術(shù)從B細(xì)胞中擴(kuò)增IgG重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，并通過(guò)測(cè)序獲得序列信息，再通過(guò)基因工程技術(shù)，進(jìn)行載體構(gòu)建、抗體表達(dá)和驗(yàn)證。

單個(gè)B細(xì)胞抗體技術(shù)制備的單克隆抗體，保留了豐富的基因多樣性及輕重鏈可變區(qū)天然配對(duì)，并且制備效率高，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于抗病毒治療、神經(jīng)性疾病治療、免疫疾病治療等抗體藥物的開發(fā)。

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