差示掃描熒光法表征蛋白配體互作，不加染料的那種

NanoTemper

2022.7.06

【實(shí)驗(yàn)解讀】

差示掃描熒光法（DSF），也被稱為thermal shift assay（TSA），是表征蛋白熱穩(wěn)定性的常用方法之一，廣泛應(yīng)用于蛋白配體互作表征，突變體、緩沖液、去垢劑篩選等領(lǐng)域。

DSF可以通過(guò)熒光染料或蛋白內(nèi)源熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)升溫過(guò)程中蛋白構(gòu)象的變化計(jì)算其熔解溫度Tm（折疊蛋白與去折疊蛋白相等時(shí)的溫度）。染料法DSF最常用的是SYPRO Orange染料，蛋白去折疊疏水區(qū)暴露時(shí)，疏水染料SYPRO Orange便會(huì)結(jié)合至該區(qū)域，熒光強(qiáng)度增加（圖1）。無(wú)標(biāo)記DSF則是基于蛋白去折疊過(guò)程中色氨酸發(fā)射光譜的位移進(jìn)行檢測(cè)（圖2）。

圖1. 染料法DSF

圖2. 無(wú)標(biāo)記DSF

當(dāng)配體的結(jié)合增強(qiáng)蛋白穩(wěn)定性時(shí)，其熔解溫度Tm也會(huì)升高。如下圖所示，未加入ATP時(shí)，Hsp90 蛋白的Tm為63.46℃，在加入ATP后，結(jié)合增強(qiáng)了Hsp90蛋白的穩(wěn)定性，Tm升高至67.53℃。因此我們可以利用該方法進(jìn)行蛋白結(jié)合活性的快速驗(yàn)證或高通量配體定性初篩。

圖3. PR蛋白穩(wěn)定性分析儀表征蛋白配體互作

在進(jìn)行蛋白配體互作表征時(shí)，染料法DSF存在一定的局限性。外源加入的染料結(jié)合至蛋白可能會(huì)直接影響蛋白的穩(wěn)定性或干擾蛋白與配體的結(jié)合，并且在蛋白形成聚集時(shí)，染料會(huì)發(fā)生解離，不適用于多結(jié)構(gòu)域蛋白的檢測(cè)。例如醛脫氫酶1A1 (ALDH1A1)在用SYPRO Orange染料檢測(cè)時(shí)僅有一個(gè)熱變性峰，并且在加入輔因子NAD+和已知的抑制劑NCT-501后并沒(méi)有出現(xiàn)明顯的Tm變化（圖4a）。而使用PR蛋白穩(wěn)定性分析儀進(jìn)行無(wú)標(biāo)記DSF檢測(cè)時(shí)，ALDH1A1呈現(xiàn)出兩個(gè)熱變性峰，在加入輔因子NAD+后，第一個(gè)熱變性峰明顯右移。繼續(xù)加入抑制劑NCT-501后，第一個(gè)熱變性峰消失，蛋白穩(wěn)定性增強(qiáng)（圖4b）[1]。

圖4 ALDH1A1 DSF檢測(cè)對(duì)比

此外，染料法DSF的實(shí)驗(yàn)操作較繁瑣，需要根據(jù)蛋白的特性及去垢劑兼容性選擇合適的染料，優(yōu)化蛋白和染料的比例，在配制樣品時(shí)還要考慮染料自帶的有機(jī)溶劑對(duì)蛋白的影響。而用PR蛋白穩(wěn)定性分析儀進(jìn)行無(wú)標(biāo)記DSF實(shí)驗(yàn)時(shí)，稀釋好樣品就可以直接上機(jī)檢測(cè)了。

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除了無(wú)標(biāo)記DSF（nanoDSF）檢測(cè)模塊外，PR蛋白穩(wěn)定性分析儀還可搭載動(dòng)態(tài)光散射（DLS），靜態(tài)光散射（SLS）和背反射（Backreflection）模塊，只需要10μl樣品就可以完成均一性，熱穩(wěn)定性，膠體穩(wěn)定性的檢測(cè)。我們還提供自動(dòng)化解決方案，便于客戶進(jìn)行無(wú)人值守的高通量篩選。