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項目文章丨蟲草及其替代品的脂質組學研究

邁維代謝

2022.5.09

前言

冬蟲夏草，是一種昆蟲幼蟲-真菌共生體。幾個世紀以來，它一直是珍貴的中藥。大量研究表明冬蟲夏草具有抗炎、免疫調節(jié)、抗氧化、抗癌等藥理活性。因此，對這種生物商品的需求不斷增加。然而，由于其專性寄生和生態(tài)地理偏好，野生蟲草資源有限。天然冬蟲夏草主要分布在青藏高原及其周邊地區(qū)，包括西藏、青海、甘肅、四川和云南。此外，由于過度采集，當?shù)厣鷳B(tài)系統(tǒng)遭到嚴重破壞，野生蟲草產量不斷下降。如今，這種產品的價格急劇上漲。

因此，供應的減少和需求的增加引起了對人工培養(yǎng)冬蟲夏草的極大興趣。目前，中國冬蟲夏草已實現(xiàn)大規(guī)模栽培，并被廣泛用作野生蟲草的潛在替代物。盡管已經取得了這些進展，但這些替代物是否具有與野生冬蟲夏草相同的藥用功能仍是人們關注的問題。

2022年4月，武漢大學中南醫(yī)院胡漢昆/李勝團隊在農林科學一區(qū)Top期刊LWT- Food Science and Technology上發(fā)表題為Lipidomicprofiling of wild cordyceps and its substituents by liquidchromatographyelectrospray ionization-tandem massspectrometry的文章，從脂質組學角度分析了野生和栽培蟲草及菌絲體中的脂質。該研究第一作者為武漢大學中南醫(yī)院藥學部臨床藥學專業(yè)研究生林嫚婷（現(xiàn)已任職福建省廈門市馬鑾灣醫(yī)院臨床藥師），與武漢大學中南醫(yī)院生物樣本庫郭珊博士。邁維代謝為本文提供廣泛靶向脂質組和定量脂質組檢測分析服務。

野生蟲草（那曲地區(qū)NCs和玉樹地區(qū)YCs）；百令膠囊(BL，批號:1911355)；栽培蟲草（CCs）

1.?野生和栽培蟲草及菌絲體的脂質組學概況

圖1A顯示，包括NCs和YCs在內的野生冬蟲夏草與CCs一樣呈昆蟲狀。然而，它們的幼蟲大小、基質長度和顏色各不相同，這可能是由于它們的生長條件和宿主幼蟲不同。對于菌絲體，可從百令膠囊中獲得，百令膠囊是將發(fā)酵的中國被毛孢粉碎后直接裝入膠囊中制成的。

QC樣本檢測到6大類，28個亞類共計435種脂質（圖1B）。值得注意的是，F(xiàn)As、GL和GPs的數(shù)量占了很大一部分（圖1C）。

通過venn圖比較野生和栽培蟲草及菌絲體中檢測到的脂質。圖1D顯示，359種脂質常見于NCs、YCs、CCs和BLs。然而，不存在NCs、YCs、CCs和BLs分別特有的脂質。此外，與NCs和YCs相比，在CCs中未檢測到7種脂質，而在BLs中未檢測到61種脂質。在野生蟲草中未檢測到TG (14:0_20:1_22:1)、TG (18:2_20:0_20:0)和TG (18:0_20:0_22:3)，但在CCs和BLs中檢測到了。在BLs、CCs或野生蟲草中未檢測到這些化合物，這可能是因為它們在每個樣本中的豐度較低?？傮w上，野生和栽培蟲草及菌絲體的脂質組成有相當大的重疊，但野生蟲草及其替代品之間存在脂質改變。

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圖1.野生和栽培蟲草及菌絲體中鑒定到的脂質

2.?NCs和YCs之間的差異分析

為了確定總體脂質組學差異的特征，進行了多變量統(tǒng)計分析。PCA結果顯示五個不同的樣本簇對應于QC、NCs、YCs、CCs和BLs(圖2A)。OPLS-DA結果顯示NCs和YCs之間存在顯著分離(圖2B)。

根據(jù)VIP≥1和FC≥2或≤0.5的特征篩選顯著差異的脂質。與NCs相比，YCs中49種脂質的含量較高，而22種脂質的含量較低(圖2C其中，類花生酸(PGE3)、CerP(d18:1/18:3)、LPC(22:2/0:0)、LPC(20:4/0:0)、LPC(O-20:1/0:0)和TG(14:0_20:0_20:2)在YCs中未檢測到，但在NCs中檢測到；TG(14:0_16:0_16:0)和TG(14:0_20:1_22:0)在NCs中未檢出，但在YCs中檢出。綜合來看，不同產地的野生蟲草具有一定的脂類差異，這可能與當?shù)鬲毺氐沫h(huán)境因素如溫度和濕度有關。因此，這些代表性脂質有望成為鑒別野生蟲草地理來源的指標。

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圖2.兩種野生蟲草(NCs和YCs)的脂類組學差異分析

3.?栽培蟲草與野生蟲草的鑒別分析

PCA(圖2A)和OPLS-DA結果(圖3A和B)均顯示CCs與野生蟲草(NCs和YCs)之間存在明顯的分離?；鹕綀D(圖3C和D)突出顯示了CCs和NCs之間的190種差異脂質(142種上調和48種下調)，以及CCs和YCs之間的177種差異脂質(124種上調和53種下調)，反映了CCs和野生蟲草的獨特脂質組學特征。此外，還發(fā)現(xiàn)CCs中含量高于野生蟲草的脂質數(shù)量多于含量低于野生蟲草的脂質數(shù)量?？傮w上，在CCs和野生蟲草之間發(fā)現(xiàn)了135種差異脂質(圖3E)。其中類二十烷酸(PGE1)、LPI(14:1/0:0)、PC(16:1_18:1)、LPC(20:3/0:0)4種脂類僅在野生蟲草中檢出，而TG(14:0_20:1_22:1)、TG(18:2_20:0_20:0)、TG(18:0_ 20:0 _ 22:3)4種脂類僅在CCs中檢出。

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圖3.CCs和野生冬蟲夏草之間的脂質組學差異分析

4.?BLs與野生蟲草的鑒別分析

同樣，分析了BLs和野生蟲草之間的脂質組學改變。PCA(圖2A)和OPLS-DA(圖4A和B)結果也顯示BL中的脂質與NC和YC中的不同。發(fā)現(xiàn)BLs和NCs之間有280種差異脂質(118種上調，162種下調)，BLs和YCs之間有312種差異脂質(121種上調，191種下調)(圖4C和D)。共篩選出BLs與野生蟲草之間的269種差異脂質(圖4E)。值得注意的是，BL與野生蟲草之間的差異脂質數(shù)量(269)大于CC與野生蟲草之間的差異脂質數(shù)量(135)，這意味著CCs與野生蟲草具有更多的共同脂質特征。這一結果可能是由于他們完全不同的栽培技術。CCs是通過人工培養(yǎng)真菌子實體獲得的，真菌子實體也可以與子囊殼和子囊孢子一起完成性成熟。然而，BLs是通過真菌發(fā)酵生產的。此外，還注意到61種脂質(表1)僅從野生蟲草(NCs和YCs)中檢測到，而TG(14:0_20:1_22:1)、TG(18:2_20:0_20:0)、TG(18:0_20:0_22:3)僅從BLs中檢測到。更重要的是，在CCs中可以檢測到這61種脂質和3種TG，表明這61種脂質是野生和栽培蟲草所特有的，這3種TG是CCs和BLs的代表性脂質(圖1D)。這3個TGs有望作為鑒別野生蟲草及其替代品(如CCs或BLs)加工品中摻假的有效標記。

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圖4.BLs與野生蟲草之間的脂質組學差異分析

5.?野生蟲草及其替代品中生物活性脂質的定量分析

在NCs、YCs、CCs和BLs中，包括FAs、SLs和GPs，一些生物活性脂質被定量分析。具體來說，SLs、LPCs和LPSs被報道與免疫調節(jié)活性有關；類花生酸、PSs、PGs、LPEs、LPGs、LPSs,和不飽和脂肪酸已被證明具有抗炎作用；PCs參與改善記憶和認知缺陷；PEs能正向調節(jié)自噬和長壽；據(jù)報道，SLs和不飽和游離脂肪酸也具有抗腫瘤活性。圖5顯示了在野生和栽培冬蟲夏草和BLs中檢測到的這些生物活性脂質的相對含量。對于冬蟲夏草而言，它們中檢測到的大多數(shù)生物活性脂質與野生冬蟲夏草沒有顯著差異。對于BLs，與野生和栽培的蟲草相比，F(xiàn)FAs(圖5A)、類花生酸(圖5B)和SLs(圖5C)的大多數(shù)生物活性脂質的含量沒有顯著改變。然而，包括PEs、PCs、LPEs、LPCs、PSs、PGs、LPGs和LPSs在內的大多數(shù)生物活性GPs的豐度發(fā)生了顯著變化，并且在BLs中更高。

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圖5.在野生和栽培蟲草及BLs中檢測到的生物活性FFA、類二十烷類和SLs的相對含量

此外，還進一步絕對定量了FFA、類二十烷類和SLs的生物活性脂質。圖6顯示，19個FFA、7個類二十烷類和9個SLs(包括2個cer、2個cert和5個SMs)得到定量。正如預期，從絕對定量(圖6)和峰面積(圖5)獲得的含量變化趨勢與在野生和栽培蟲草及BLs中檢測到的這些脂質一致。例如，兩種檢測方法均未在BLs中檢測到FFA(14:1)和FFA(20:5)。此外，BLs中FFA(16:1)、FFA(22:5)、13-oxoODE,9-oxoODE、9-HOTrE、13-HOTrE、9，10-DiHOME和SM(d18:1/16:1)的含量也明顯低于野生和栽培蟲草。但BLs中Cer(d18:1/16:0)、Cer(t18:0/24:0)、SM(d18:1/14:0)含量均高于野生和栽培蟲草。該結果表明了基于峰面積的差異分析的可靠性?？傊煌x草樣品中這些生物活性脂質的含量不同，CCs與野生蟲草的差異小于BLs與野生蟲草的差異。

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圖6.在野生和栽培蟲草及BLs中檢測到的一些生物活性FFA、類二十烷類和SLs的絕對定量結果

本研究首次基于LC-ESI-MS/MS分析了野生和栽培蟲草及菌絲體的脂質組學特征。對野生冬蟲夏草及其替代品的脂質提供了全面的見解，不僅為其藥理作用提供了化學證據(jù)，還促進了更好的質量控制。

后記

1.2021年12月，武漢大學生命科學學院及中南醫(yī)院王業(yè)富/周立/胡漢昆教授團隊在Journalof Functional Foods期刊發(fā)表了題為“Oraltherapy of recombinant Subtilisin QK-2 potentiates thrombolyticeffect in a carrageenan-induced thrombosis animalmodel”的研究論文，探究了功能性食品成分的枯草桿菌蛋白酶QK體內的溶栓作用。

2.2021年7月，武漢大學肖玉秀/胡漢昆教授團隊在FoodChemistry期刊發(fā)表了題為“Adensity-tunable liquid-phase microextraction system based on deepeutectic solvents for the d eterminationof polycyclic aromatichydrocarbons in tea, medicinal herbs and liquidfoods”的研究論文，研制了一種新型密度可調的液相微萃取(DT-LPME)系統(tǒng)，DT-LPME法簡單、快速、綠色，適用于從液體和固體樣本中直接提取分析物。

3.2020年8月，武漢大學中南醫(yī)院胡漢昆主任藥師/副教授在Analyticaland Bioanalytical Chemistry期刊發(fā)表了題為“Fastquantification of free amino acids in food by microfluidicvoltage–assisted liquid desorption electrospray ionization–tandemmassspectrometry”的研究成果，建立了一種基于微流控電壓輔助液體解吸電噴霧電離-串聯(lián)質譜(VAL-DESI-MS/MS)的快速定量食品中游離氨基酸的方法。

4.2020年2月，同濟大學/武漢大學中南醫(yī)院的范震/胡漢昆團隊在ChineseChemical ?Letters期刊發(fā)表了題為“Theapplication of biomacromolecules to improve oral absorption byenhanced intestinal permeability: Amini-review”的研究成果，總結了生物大分子通過增強腸道通透性改善口服吸收的應用。

5.2020-2022年，胡漢昆主任藥師/副教授所獲得授權中國發(fā)明專利情況如下：

項目名稱專利類型專利號排名獲批時間

一種鹽酸二甲雙胍化合物及鹽酸二甲雙胍片組合物發(fā)明 ZL2019610056273第一2022.03

碳酸氫鈉林格注射液及其制備方法發(fā)明 0Z6L326051794.10第一2021.07

一種高效液相色譜法測定蟲草中蟲草素含量的方法發(fā)明 0Z6L929061291.16第一2021.05

醋酸阿比特龍制劑及其制備方法發(fā)明 1Z2L225091893.18第一2021.04

一種鹽酸多巴胺注射液及其制備方法發(fā)明 0Z3L823072808.14第一2021.02

碳酸氫鈉注射液包裝用碳酸氫鈉緩釋片發(fā)明 ZL202031.4086482第一2020.08

一種可提供生理應急幫助的醫(yī)用防護服實用新型 ZL202021544811.5第一2020.07

一種恩雜魯胺化合物及其藥物組合物制劑發(fā)明 0Z0L092805280.X1第二2020.01

往期精彩：

●高峰論壇 | 真4D蛋白質組學，引領高通量蛋白質組學4D時代