項(xiàng)目文章 | 多組學(xué)聯(lián)合（轉(zhuǎn)錄組+代謝組）在環(huán)境暴露方向的應(yīng)用案例

邁維代謝

2022.4.22

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2022年3月，第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院眼科徐海偉教授研究團(tuán)隊(duì)在環(huán)境科學(xué)與生態(tài)學(xué)JCR分區(qū)Q1EnvironmentInternational（IF9.621）期刊發(fā)表了題為“Evaluationof the influences of low dose polybrominated diphenyl ethers exposureon human early retinaldevelopment”的研究論文。本研究采用代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示了低水平BDE-47（2,2,4,4-四溴二苯醚，是生物樣品中最常檢測(cè)到的多溴二苯醚同系物）的視網(wǎng)膜毒性潛在機(jī)制，并強(qiáng)調(diào)了hESC-RO模型的有效性，加深了對(duì)BDE-47驅(qū)動(dòng)的人類早期視網(wǎng)膜發(fā)育毒性的理解。邁維代謝為本次研究提供了非靶向代謝組檢測(cè)分析服務(wù)。

?●?發(fā)表單位：第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院

?●?期刊：EnvironmentInternational

?●?影響因子：9.621

?●?發(fā)表時(shí)間：2022.03

最近，環(huán)境化學(xué)物質(zhì)在視網(wǎng)膜中的積累及其對(duì)視網(wǎng)膜發(fā)育的毒性作用越來越受到重視。在動(dòng)物模型中，越來越多的證據(jù)表明，多溴二苯醚(PBDEs)，一種溴化阻燃劑，可以引起視網(wǎng)膜毒性。然而，由于缺乏適當(dāng)?shù)哪Ｐ停P(guān)于多溴二苯醚對(duì)人類視網(wǎng)膜發(fā)育影響的研究十分匱乏。

近年來，hESC-ROs（人類胚胎干細(xì)胞-視網(wǎng)膜類器官）被認(rèn)為是剖析環(huán)境應(yīng)激引起的人類視網(wǎng)膜發(fā)育障礙過程的一個(gè)很好的模型。本研究首次采用hESC-RO模型研究了低劑量多溴二苯醚暴露對(duì)人類早期視網(wǎng)膜發(fā)育的影響。

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1.?hESC來源的視網(wǎng)膜類器官的產(chǎn)生和鑒定

為了模擬人類胚胎視網(wǎng)膜的發(fā)育，參考已發(fā)表的方法構(gòu)建hESC-ROs，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，hESC-RO模型成功建立。

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圖1所示。hESC來源的視網(wǎng)膜類器官的產(chǎn)生和鑒定。A:不同分化時(shí)間點(diǎn)(D1、D6、D18、D32、D53)的hESC-ROs相差顯微鏡圖像，顯示神經(jīng)視網(wǎng)膜層(黑色三角形、紅色矩形)的連續(xù)形態(tài)變化。B,C: HuC/D和RAX,SOX2和PAX6在D32的hESC-ROs免疫染色。D、E:BRN3、SOX2、Crx、CHX10在D39的hESC-ROs免疫染色;白色矩形的放大倍數(shù)，如d1和d2所示。F-H:ZO-1和CHX10、HuC/D和CHX10、recoverin和HuC/D在D53時(shí)的hESC-ROs免疫染色。

2.?多溴二苯醚引發(fā)hESC-ROs形態(tài)異常

從D18開始進(jìn)行持續(xù)五周的PBDE處理(圖2A)?；贐DE-47劑量依賴性,選擇低劑量的0.01μM和0.1μM。有趣的是，暴露于BDE-47兩周和三周后，NRs（神經(jīng)視網(wǎng)膜）和hESC-ROs的厚度、面積和NR的百分比均有所增加(圖2C,D)，而暴露于BDE-47五周后，NRs和hESC-ROs的厚度、面積和NR的比例均有所下降。

處理5周后，與對(duì)照組相比，0.01μM和0.1μM BDE-47處理可顯著降低NRs厚度，且hESC-ROs面積減少。0.1μM BDE-47處理后，hESC-ROs的NR百分比顯著降低，而0.01μMBDE-47暴露組與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為了進(jìn)一步驗(yàn)證多溴二苯醚誘導(dǎo)的形態(tài)改變，hESC-ROs暴露于另一種多溴二苯醚同系物BDE-209，以及BDE-47，BDE-47/209混合物中，與上述結(jié)果相似。為了驗(yàn)證多溴二苯醚的毒性作用，作者還對(duì)BDE-47、BDE-209和BDE-47/209暴露進(jìn)行了毒性評(píng)估。結(jié)果表明，多溴二苯醚對(duì)hESC-ROs的生長(zhǎng)具有劑量和時(shí)間依賴性，其形態(tài)學(xué)變化包括厚度、面積、NRs的百分比。

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圖2所示。多溴二苯醚暴露對(duì)hESC-ROs生長(zhǎng)的影響。A:誘導(dǎo)方案和多溴二苯處理hESC-ROs的示意圖。hESC-ROs暴露于多溴二苯醚中，時(shí)間從D18到D53(持續(xù)5周)。B:經(jīng)BDE-47治療2周、3周、5周的hESC-ROs代表性相位對(duì)比圖(NR層:紅色三角環(huán)區(qū))。C,D: BDE-47暴露2周、3周、4周、5周后hESC-ROs中NRs的厚度和面積定量分析。

3.?多溴二苯醚影響hESC-ROs細(xì)胞增殖和凋亡

為了揭示多溴二苯醚對(duì)hESC-ROs視網(wǎng)膜神經(jīng)元的影響，進(jìn)行免疫熒光染色和TUNEL染色。與對(duì)照組相比，0.01μM和0.1μM的BDE-47處理5周后Ki67增殖細(xì)胞陽性率降低，暴露于BDE-47在2周或3周時(shí)，Ki67水平?jīng)]有顯著變化。相反，BDE-47暴露誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。0.01μM和0.1μM BDE-47處理組tunel陽性凋亡細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組;0.1μMBDE-47對(duì)tunel陽性細(xì)胞比例也有影響，但0.01μM BDE-47對(duì)tunel陽性細(xì)胞比例的影響不顯著(圖3A,C)。此外，免疫熒光染色顯示，0.01μM和0.1μM BDE-47處理5周后，cleaved-caspase3陽性細(xì)胞比例顯著增加(圖3D)。有趣的是，暴露于BDE-47在5周后，NRs中發(fā)現(xiàn)了典型的玫瑰花狀結(jié)構(gòu)(圖3A)。玫瑰結(jié)的形成可能是由BDE-47誘導(dǎo)視網(wǎng)膜細(xì)胞異常增殖引起的(Shiraiet al. 2016)。提示BDE-47能抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

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圖3所示。暴露5周后，hESC-ROs的增殖和凋亡受到影響。A:經(jīng)PBDE(0.01 μM和0.1μM)處理5周后，hESC-ROs中ki67陽性增殖細(xì)胞、TUNEL和cleaved-caspase3陽性凋亡細(xì)胞的代表性免疫染色圖像。NRs上可見典型的神經(jīng)玫瑰狀結(jié)構(gòu)(白色三角形)。B-D:定量分析BDE-47作用5周后NRski67增殖陽性細(xì)胞和TUNEL、cleaved-caspase3陽性凋亡細(xì)胞的比例。

4.?多溴二苯醚影響hESC-ROs的細(xì)胞分化

作者進(jìn)一步研究了BDE-47對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞分化的影響。免疫染色數(shù)據(jù)顯示，對(duì)照組視網(wǎng)膜無長(zhǎng)突細(xì)胞/神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(HuC/D)有規(guī)律地分布于NRs基底側(cè)(圖4A、1B、1G、1H)。暴露于BDE-47在5周后，NRs上發(fā)現(xiàn)HuC/D陽性細(xì)胞分布紊亂(圖4A),HuC/D陽性細(xì)胞比值明顯降低;此外，BDE-47暴露5周后，BRN3-陽性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的比例顯著降低;有趣的是，在BDE-47處理后，CHX10陽性視網(wǎng)膜祖細(xì)胞(RPCs)在NRs的頂端側(cè)排列紊亂，并填補(bǔ)了HuC/D陽性細(xì)胞之間的間隙。此外，在NRs的基底側(cè)也發(fā)現(xiàn)PAX6陽性細(xì)胞排列紊亂。

與NRs頂端和基底兩側(cè)的光感受器前體細(xì)胞(Crx)的規(guī)律性分布相比，BDE-47暴露引起Crx陽性細(xì)胞排列紊亂(圖4A)。此外，部分Crx陽性的光感受器前體細(xì)胞分布成玫瑰花狀結(jié)構(gòu)。同時(shí)，0.01μM BDE-47處理組Crx陽性前體細(xì)胞比例顯著增加，而0.1μM BDE-47處理組Crx陽性前體細(xì)胞比例沒有顯著增加(圖4D)。此外，經(jīng)0.01μM BDE-47處理5周后，hESC-ROs中CrxmRNA表達(dá)上調(diào)，提示低水平BDE-47可誘導(dǎo)Crx陽性的光感受器前體細(xì)胞分化。0.1μM BDE-47處理5周后，恢復(fù)素陽性的光感受器細(xì)胞明顯減少，而0.01μMBDE-47處理5周后恢復(fù)素陽性的光感受器細(xì)胞明顯減少(圖4E)。同樣，暴露于BDE-47后，恢復(fù)素陽性的光感受器細(xì)胞在NRs中分布不規(guī)則。

用qRT-PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示，BDE-47暴露5周后，BRN3b(視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞標(biāo)志物)和recoverinmRNA表達(dá)下調(diào)。這些結(jié)果與上述HuC/D的免疫染色數(shù)據(jù)一致(圖4A,B)。此外，BDE-47還引起了CHX10(RPC標(biāo)記物)的失調(diào)。這些結(jié)果表明，BDE-47暴露5周后，視網(wǎng)膜細(xì)胞(包括無長(zhǎng)突細(xì)胞/神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和光感受器細(xì)胞)的分化受到影響。

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圖4所示。暴露5周后，hESC-ROs的分化受到影響。A:經(jīng)BDE-47處理5周后的hESC-ROsHuC/ D陽性無長(zhǎng)突細(xì)胞/神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、BRN3陽性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、Crx陽性光感受器前體細(xì)胞和恢復(fù)素陽性光感受器細(xì)胞的代表性免疫染色圖像。B-E:定量分析BDE-47暴露5周后NRs細(xì)胞HuC/D-、BRN3-、Crx-和恢復(fù)陽性細(xì)胞的比值。

5.?hESC-ROs對(duì)多溴二苯醚應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄組分析

應(yīng)用RNA-seq分析方法研究BDE-47暴露后hESC-ROs的差異表達(dá)基因(DEGs)。DEGs定義為P-value< 0.05 且foldchange >1.2或者<0.8.。其中，與對(duì)照組相比，BDE-47暴露于0.01μM和0.1μM的hESC-ROs中，分別有154個(gè)和309個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào)，對(duì)應(yīng)55個(gè)和63個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào)?；鹕綀D表示了這些DEGs的分布(圖5A、B)。Venn圖顯示，在0.01和0.1μM BDE-47暴露組中，均發(fā)現(xiàn)了101個(gè)DEGs，其中82個(gè)基因上調(diào)，19個(gè)基因下調(diào)。

為了進(jìn)一步了解這些DEGs，作者進(jìn)行了GO注釋分析以確定其生物學(xué)過程。細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織、細(xì)胞外基質(zhì)組織、ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)、細(xì)胞底物黏附、感覺器官形態(tài)發(fā)生、BMP信號(hào)通路、細(xì)胞解毒、細(xì)胞氧化解毒、干細(xì)胞發(fā)育、根據(jù)基因數(shù)目，0.01μM BDE-47顯著富集胰島素樣生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路(圖5D)。數(shù)據(jù)還顯示，與對(duì)照組相比，0.1μM BDE-47暴露組比0.01μM暴露組識(shí)別出更多的差異項(xiàng)(圖5D,E)。此外，0.01μM與0.1μMBDE-47影響的條目有大量重疊，包括細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織、細(xì)胞外基質(zhì)組織、細(xì)胞底物黏附、ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)、BMP信號(hào)通路等。前兩項(xiàng)：細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織和細(xì)胞外基質(zhì)組織，參與了脫細(xì)胞間質(zhì)微環(huán)境，表明BDE-47可能破壞了在胚胎發(fā)生、組織特異性發(fā)育和干細(xì)胞分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用的細(xì)胞外基質(zhì)。

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圖5所示。0.01μM和0.1μM BDE-47對(duì)hESC-ROs的轉(zhuǎn)錄組分析。A、B:0.01 μM和0.1μM BDE-47暴露組與對(duì)照組的hESC-ROs中DEG的火山圖。C:DEG維恩圖。D、E:GO注釋分析。

KEGG通路注釋在BDE-47暴露的hESC-ROs中顯示，DEG可以被分為5項(xiàng)，如代謝、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過程、有機(jī)體系統(tǒng)和人類疾病(圖6A,B）;KEGG通路注釋顯示，被識(shí)別的部分DEGs與環(huán)境信息處理中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)。此外，與DMSO(二甲基亞砜)對(duì)照相比，蛋白消化吸收和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)受體相互作用被確定為0.01和0.1μM BDE-47處理的重要途徑。

考慮到基因相互作用在發(fā)育過程中的重要性，作者利用STRING在線數(shù)據(jù)庫對(duì)101個(gè)DEGs進(jìn)行分析，創(chuàng)建一個(gè)相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖6C)。在這些相互作用的基因中，利用qRT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證候選蛋白包括:對(duì)樣同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子2(PITX2)、ephrintype-A receptor 2 (EPHA2)、膠原α-1(V) (COL5A1)、膠原α-1(I) (COL1A1)和S100鈣結(jié)合蛋白A9(S100A9)。結(jié)果顯示，BDE-47治療5周后，PITX2COL5A1、COL1A1和S100A9mRNA表達(dá)上調(diào)，EPHA2表達(dá)下調(diào)(圖6D)。

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圖6所示。hESC-ROs暴露于BDE-47的關(guān)鍵途徑分析。A、B:0.1 μMBDE-47對(duì)hESC-ROs富集的前20條通路。第一圈顯示了富集的通路和相關(guān)基因的數(shù)量,第二圈顯示基因組背景中的基因數(shù)量和富集-log10(P-value),第三圈顯示下調(diào)基因(淡紫色)和上調(diào)基因(深紫色)比例,第四圈顯示了富集因子。C:基于STRING(11.5)數(shù)據(jù)庫的101個(gè)DEGs基因相互作用網(wǎng)絡(luò)。未連接的節(jié)點(diǎn)被隱藏;紅色表示DEGs與細(xì)胞遷移有關(guān)，藍(lán)色表示DEGs與細(xì)胞分化有關(guān)，綠色表示DEGs與眼睛發(fā)育有關(guān)，黃色表示DEGs參與抗氧化活性。D:采用qRT-PCR檢測(cè)BDE-47暴露的hESC-ROs中PITX2、EPHA2、COL5A1、COL1A1和S100A9mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

6.?hESC-ROs對(duì)BDE-47應(yīng)答的代謝組分析

利用LC-MS-MS對(duì)BDE-47引起的hESC-ROs代謝變化進(jìn)行代謝組學(xué)分析。通過OPLS-DA分析發(fā)現(xiàn)BDE-47暴露后hESC-ROs的代謝變化相當(dāng)明顯(圖7A)?；鹕綀D在0.01μM和0.1μM BDE-47暴露組中呈現(xiàn)出明顯的上調(diào)和下調(diào)特征(圖7B)。在顯著失調(diào)的特征中，與對(duì)照組相比，暴露于0.01μM和0.1μM BDE-47的hESC-ROs中分別發(fā)現(xiàn)了84和121個(gè)顯著失調(diào)的代謝物(圖7C)。Venn圖顯示，在0.01μM和0.1μM bde-47暴露的hESC-ROs中，40種代謝物均出現(xiàn)異常。在這些異常代謝產(chǎn)物中，分別有24個(gè)代謝產(chǎn)物表達(dá)上調(diào)，16個(gè)代謝產(chǎn)物表達(dá)下調(diào)。熱圖顯示了暴露于BDE-47在5周后顯著失調(diào)的代謝產(chǎn)物。通過KEGG通路分析，確定了0.1μM BDE-47處理后的通路。然而，在5周時(shí)，KEGG通路將0.01μM BDE- 47與乙醛酸和二羧酸代謝、嘌呤代謝聯(lián)系起來(圖7D)。此外，與0.01μM BDE-47暴露組相比，0.1μM BDE-47暴露組的hESC-ROs中發(fā)現(xiàn)了48種顯著失調(diào)的代謝產(chǎn)物。在這些異常代謝產(chǎn)物中，31個(gè)上調(diào)，17個(gè)下調(diào)。

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圖7所示。0.01μM和0.1μM BDE-47對(duì)hESC-ROs的代謝組分析。A:對(duì)照組和BDE-47兩劑量處理組hESC-RO代謝物的OPLS-DA評(píng)分圖。B:hESC-ROs代謝紊亂的火山圖，比較0.01μMBDE -47暴露組和對(duì)照組。C:劑量相關(guān)模塊中代謝紊亂的維恩圖。D:與對(duì)照組相比，在0.01μM BDE -47暴露的hESC-ROs中，KEGG富集失調(diào)的代謝通路。

7.?轉(zhuǎn)錄組和代謝組的整合分析揭示了hESC-ROs對(duì)多溴二苯醚暴露的響應(yīng)

為了深入了解多溴二苯醚對(duì)視網(wǎng)膜發(fā)育的毒性作用，作者使用MetaboAnalyst5.0 (https://www.metaboanalyst)構(gòu)建了上述代謝物和基因的綜合網(wǎng)絡(luò)分析。在0.01μM BDE-47處理后，未發(fā)現(xiàn)任何顯著的代謝產(chǎn)物和基因網(wǎng)絡(luò)。然而，0.1μM BDE-47暴露的hESC-ROs代謝產(chǎn)物和DEGs的整合網(wǎng)絡(luò)主要集中在谷胱甘肽、苯乙胺和大豆黃酮和草酸代謝(圖8A-C)。0.1μM BDE-47處理后，hESC-ROs中谷胱甘肽和草酸表達(dá)上調(diào)，苯乙胺和大豆苷元表達(dá)下調(diào)。暴露于BDE-47在5周后，谷胱甘肽代謝與DEGs的表達(dá)有關(guān)，包括谷胱甘肽過氧化物酶2(GPX2)、γ谷氨?；D(zhuǎn)移酶1(GGT1)、己糖-6-磷酸脫氫酶(H6PD)、谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶α1(GSTA1)、脂質(zhì)過氧化物酶(LPO)和白蛋白(ALB)。qRT-PCR結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了BDE-47處理5周后GPX2、GSTA1、ALB基因表達(dá)上調(diào)，GGT1表達(dá)下調(diào)(圖8D)。

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圖8所示?；贛etaboAnalyst平臺(tái)的差異代謝產(chǎn)物和差異基因的網(wǎng)絡(luò)分析。A-C:分別是谷胱甘肽、苯乙胺、大豆黃酮和草酸的代謝網(wǎng)絡(luò)。圓形代表差異基因，立方代表差異代謝物。紅色表示上調(diào)，綠色表示下調(diào)。D:采用qRT-PCR檢測(cè)BDE-47暴露的hESC-ROs中GPX2、GSTA1、GGT1和ALBmRNA的相對(duì)表達(dá)量。

總之，本研究通過hESC-RO模型揭示了多溴二苯醚潛在的人類早期視網(wǎng)膜發(fā)育毒性。本文證明，低劑量多溴二苯醚可能會(huì)產(chǎn)生多方面的早期發(fā)育毒性，影響視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的增殖、遷移和分化。代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析是識(shí)別分子標(biāo)記的有力工具，并證明了細(xì)胞外基質(zhì)組織和嘌呤和谷胱甘肽的代謝參與了多溴二苯醚的視網(wǎng)膜毒性。今后研究仍然需要進(jìn)一步闡明多溴二苯醚引起視網(wǎng)膜發(fā)育毒性的完整分子機(jī)制。

本文采用非靶向代謝組學(xué)檢測(cè)分析方法。在此技術(shù)基礎(chǔ)上，邁維代謝研發(fā)了TM廣靶：該方法將非靶（高分辨、廣覆蓋）與廣靶（高靈敏、精定量）完美結(jié)合：首先用高分辨TOF對(duì)樣本進(jìn)行二級(jí)譜掃描，提取MRM離子對(duì)信息，再整合廣靶庫構(gòu)建樣本的特異性數(shù)據(jù)庫，最后利用Q-TRAP對(duì)庫中物質(zhì)開展MRM精準(zhǔn)檢測(cè)，極大地提升了有效數(shù)據(jù)量。

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1. 廣泛靶向定位重要常見物質(zhì)；

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