項(xiàng)目文章 | IF=13！TM廣靶助力強(qiáng)化結(jié)腸癌放療仿生納米載體研究

邁維代謝

2022.2.25

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?●?期刊：Small

?●?影響因子：13.28

?●?發(fā)表時(shí)間：2022.02.12

2022年2月12日，西安交通大學(xué)第一附屬院腫瘤放療科龔柳云博士（一作），韓蘇夏教授和張明真研究員（通訊作者）在材料領(lǐng)域權(quán)威期刊Small上發(fā)表題為“All-In-One Biomimetic Nanoplatform Based on Hollow Polydopamine Nanoparticles for Synergistically Enhanced Radiotherapy of Colon Cancer”的文章，影響因子13.28分。邁維代謝為該研究提供了代謝組學(xué)檢測(cè)服務(wù)。

全文概覽

放射治療是結(jié)腸癌治療中最重要的治療策略，但是在實(shí)體瘤破壞中仍有提高放射敏感性的巨大需求。為此，本文設(shè)計(jì)了一種基于中空聚多巴胺納米粒子(HP)的仿生納米載體，其具有同源靶向和pH響應(yīng)藥物釋放特性。在這項(xiàng)工作中，HP是通過螯合競爭誘導(dǎo)聚合策略構(gòu)建的，然后用癌細(xì)胞膜修飾。仿生納米載體同時(shí)具有介孔殼和大空腔的結(jié)構(gòu)，能高效負(fù)載Apoptin100-109（AP）和維替泊芬（VP）（AVPt@HP@M）。在X射線照射下，AVPt@HP@M通過緩解缺氧（Pt）、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡（AP）和X-射線誘導(dǎo)的光動(dòng)力（X-PDT）（VP）等多種途徑實(shí)現(xiàn)結(jié)腸癌的放療增敏。

代謝組學(xué)分析表明，在沒有明顯的全身毒性的情況下，AVPt@HP@M影響了嘌呤代謝，這種納米載體為實(shí)現(xiàn)有效的放射增敏提供了新策略，具有重要的科學(xué)意義和臨床參考價(jià)值。

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圖1

AVPt@HP@M NPs的合成和表征

首先，通過硝酸鋅和2-甲基咪唑合成了沸石咪唑骨架8 (ZIF-8)納米粒子。還通過向反應(yīng)中加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)改性的Pt納米顆粒來合成Pt@ZIF-8。當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)中存在過量的多巴胺時(shí)，多巴胺通過螯合競爭誘導(dǎo)的聚合取代2-甲基咪唑，形成Pt摻雜的中空聚多巴胺納米顆粒(Pt@HP)。通過透射電子顯微鏡(TEM)掃描ZIF-8, Pt@ZIF-8, ?Pt@HP 的顆粒尺寸和形態(tài)，證實(shí)了納米顆粒的成功形成(圖2A)。Pt@HP是中空結(jié)構(gòu)，其與癌細(xì)胞膜碎片混合并在冰浴中攪拌后，這種中空載體被癌細(xì)胞膜覆蓋，從而獲得仿生納米載體(Pt@HP@M)。western blot和考馬斯亮藍(lán)染色的結(jié)果顯示，Pt@HP@M所包含的蛋白質(zhì)與細(xì)胞膜蛋白質(zhì)輪廓相似(圖2E)，表明膜的功能蛋白質(zhì)成功地包被在Pt@HP上。AP和VP加載后，在VAPt@HP吸收中出現(xiàn)AP (220 nm)和VP (420和690 nm)的相同吸收峰，表明這些藥物成功加載到Pt@HP中(圖3C)。FTIR光譜分析進(jìn)一步支持AP和VP的成功加載，特征峰出現(xiàn)在VAPt@HP中(圖3D)。AVPt@HP@M的大小和多分散性指數(shù)(PDI)在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(含10%胎牛血清[FBS])中7天沒有顯著變化(圖3G)，這表明AVPt@HP@M具有出色的穩(wěn)定性，有可能用于體內(nèi)研究。如TEM所示，AVPt@HP@M在三種不同pH值的溶液中保持4小時(shí)，并保持pH值為7.4，在pH值為6.5時(shí)會(huì)發(fā)生降解。當(dāng)pH值降至5.5時(shí)，顆粒完整性被破壞并完全分解，這表明AVPt@HP@M將在酸性TME中降解。受AVPt@HP@M的pH響應(yīng)行為的啟發(fā)，對(duì)AVPt@HP@M在不同pH條件下的藥物釋放曲線進(jìn)行了評(píng)估(圖3H，I)。相比 pH 7.4時(shí)，AP和VP的累積釋放量在酸性條件下顯著增加。

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圖2

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圖302

受AVPt@HP@M的細(xì)胞攝取

用癌細(xì)胞膜包裹納米粒子的偽裝策略允許通過自我識(shí)別、同型靶向和延長的系統(tǒng)循環(huán)來實(shí)現(xiàn)優(yōu)異的腫瘤靶向，從而有助于有效的腫瘤治療。共聚焦成像顯示，與MCF-7和Hela細(xì)胞相比，AVPt@HP與HCT-116細(xì)胞膜的仿生結(jié)合導(dǎo)致了對(duì)HCT-116細(xì)胞更高的特異性自我識(shí)別(圖4A)。此外，流式細(xì)胞儀分析定量檢測(cè)顯示，HCT-116細(xì)胞中Pt@HP@M的熒光高達(dá)99.83%，顯著高于MCF-7細(xì)胞(54.5%)和Hela細(xì)胞(67.92%)(圖4B)。FE-SEM圖像顯示HCT-116細(xì)胞上有大量Pt@HP@M(用黃色箭頭標(biāo)記)，表明偽裝策略介導(dǎo)的主動(dòng)靶向可以提高納米顆粒與細(xì)胞之間的結(jié)合能力。這些結(jié)果支持了同源腫瘤的自我靶向和“歸巢”能力，同時(shí)與其他異源腫瘤競爭。

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圖403

AVPt@HP@M減輕缺氧并增強(qiáng)活性氧生成

缺氧的腫瘤微環(huán)境限制了放療的療效，增加實(shí)體癌組織中的氧含量可以顯著提高放射增敏。接下來評(píng)估AVPt@HP@M緩解細(xì)胞內(nèi)缺氧的能力。將HCT-116細(xì)胞在正常和缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。[Ru(dpp)3]Cl2可指示細(xì)胞內(nèi)氧氣水平，并用于檢測(cè)治療前后常氧和低氧條件下的氧氣水平。[Ru(dpp)3]Cl2的紅色熒光越強(qiáng)，表明細(xì)胞內(nèi)氧氣濃度越低。常氧組細(xì)胞內(nèi)紅色熒光明顯弱于缺氧組。HP@M處理4 h后，常氧組和低氧組的紅色熒光與對(duì)照組相比無明顯變化。相反，當(dāng)用Pt@HP@M處理4小時(shí)時(shí)，正常氧組和缺氧組的細(xì)胞中的紅色熒光顯著減少，表明Pt@HP@M中的Pt催化氧的產(chǎn)生并緩解缺氧。本文還評(píng)估了用納米粒子處理的輻射(IR)產(chǎn)生的ROS。DCFH-DA是一種ROS探針，常用于檢測(cè)H2O2 含量和氧化應(yīng)激。當(dāng)用IR或AVPt@HP@M處理時(shí)，細(xì)胞中出現(xiàn)一點(diǎn)綠點(diǎn)，與對(duì)照組相比沒有顯著差異，這可能歸因于活細(xì)胞內(nèi)源性產(chǎn)生的ROS。當(dāng)用IR和納米粒子(APt@HP@M、VPt@HP@M和AVPt@HP@M)一起處理時(shí)，細(xì)胞中的綠點(diǎn)顯著增加，并且AVPt@HP@M + IR處理組顯示出最強(qiáng)的綠色熒光，表明大量ROS產(chǎn)生。AVPt@HP@M納米顆粒顯著增加了細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平，具有提高體內(nèi)放射敏感性的潛力。

AVPt@HP@M的體外療效

通過CCK-8試驗(yàn)評(píng)估顯示Pt@HP@M的生物相容性很出色。接下來評(píng)價(jià)在IR下AVPt@HP@M的治療效果。研究發(fā)現(xiàn)，IR或納米粒子(APt@HP@M、VPt@HP@M和AVPt@HP@M)單獨(dú)處理對(duì)細(xì)胞活力有輕微影響。相反，當(dāng)納米粒子和IR一起處理時(shí)，細(xì)胞生長被顯著抑制。治療效果與納米顆粒濃度呈正相關(guān)。AP和VP在降解后從AVPt@HP@M中釋放出來，分別作為放射增敏劑和光敏劑，AP和VP被IR激活，對(duì)放射治療產(chǎn)生增敏作用。

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圖505

AVPt@HP@M在體內(nèi)的生物相容性

為了保證納米粒子在體內(nèi)應(yīng)用的安全性，有必要對(duì)其進(jìn)行生物安全性評(píng)價(jià)。接下來在體內(nèi)評(píng)估了AVPt@HP@M的細(xì)胞毒性效應(yīng)。每3天給小鼠靜脈注射PBS或AVPt @ HP @ M共4次，并在初次注射后15天和30天收集小鼠血液。血液分析和生化分析結(jié)果表明，注射PBS和AVPt @ HP @ M之間無顯著差異。?15天和30天后的分組(圖S10A，支持信息)。以丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)作為肝臟的損傷指標(biāo)，以血尿素氮(BUN)和肌酐(CR)作為腎臟的損傷指標(biāo)評(píng)估了AVPt@HP@M對(duì)小鼠肝臟和腎臟的潛在損傷。與PBS注射組相比，無論是15天還是30天，ALT、AST、BUN和CR均無明顯差異。這些結(jié)果表明，AVPt@HP@M對(duì)肝臟和腎臟沒有造成損害。同時(shí)，在多次注射AVPt@HP@M后，所有組的心臟、肝臟、肺和腎臟器官指數(shù)均無顯著差異。AVPt@HP@M具有良好的生物相容性，在體內(nèi)具有治療應(yīng)用潛力。

AVPt@HP@M的體內(nèi)治療效果

紅細(xì)胞溶血嚴(yán)重限制了納米粒子的體內(nèi)應(yīng)用。本文研究了AVPt@HP@M的溶血能力，結(jié)果表明AVPt@HP@M不引起明顯的溶血。Pt@HP@M (HCT-116)組腫瘤區(qū)域的DiR熒光信號(hào)高于Pt@HP@M (HCF-7)、Pt@HP@M (Hela)和 Pt@HP組，驗(yàn)證了Pt@HP@M對(duì)同源腫瘤的顯著自靶向能力。腫瘤切片的H&E染色顯示AVPt@HP@M + IR治療組比其他組壞死更多。在對(duì)照組、IR組和AVPt@HP@M治療組的腫瘤切片中發(fā)現(xiàn)少量TUNEL陽性凋亡細(xì)胞(綠點(diǎn)),證明AVPt@HP@M在體內(nèi)具有良好的生物相容性。同時(shí)，AVPt@HP@M + IR治療組的腫瘤切片顯示出比APt@HP@M + IR和VPt@HP@M + IR組高得多的凋亡率(圖7E)，表明APt@HP@M + IR抑制了實(shí)體瘤中的腫瘤生長。

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圖6

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圖707

AVPt@HP@M對(duì)RT增敏的機(jī)制

AVPt@HP@M中的AP和VP通過不同的途徑發(fā)揮放射增敏作用。WB結(jié)果顯示，VP處理可以降低LC3脂質(zhì)化表達(dá)，并增加選擇性自噬底物P62表達(dá)(圖8A)，表明自噬受到抑制，與以前的報(bào)道一致。有缺陷的DSB修復(fù)可導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化、細(xì)胞死亡和腫瘤發(fā)生。APt@HP@M + IR在結(jié)直腸癌(HCT-116和HT-29細(xì)胞)中引起DSB積累，AVPt@HP@M + IR引起DSB積累增加。AVPt@HP@M仿生納米載體同時(shí)遞送AP和VP，解決了放射治療中放射增敏劑遞送的空間和時(shí)間控制的關(guān)鍵問題，從而提高了它們的治療效果。

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圖808

代謝組學(xué)研究

癌癥相關(guān)蛋白表達(dá)的改變可以增加代謝物的水平，從而促進(jìn)癌癥的發(fā)生和發(fā)展。一些特定代謝物水平的變化可以導(dǎo)致癌細(xì)胞中信號(hào)通路的改變。使用LC-ESI-MS/MS系統(tǒng)將樣品提取物用于代謝物分析，通過該系統(tǒng)分析來自用PBS、IR和AVPt@HP@M + IR處理的小鼠的血液樣品。PLS-DA結(jié)果如圖9A所示，在批量分析過程中，每組中的所有樣品都緊密聚集在一起，這表明經(jīng)過不同處理的樣品明顯分離。在對(duì)照組和IR組中總共鑒定出112種代謝物；在對(duì)照組和AVPt@HP@M + IR組之間鑒定出416種代謝物，在IR組和AVPt@HP@M + IR組之間鑒定出153種代謝物。每組中代謝物的最高差異表達(dá)如圖9B所示。排除批次效應(yīng)后，75種代謝物被認(rèn)為是受AVPt@HP@M + IR影響的重要代謝物(圖9C)。在用AVPt@HP@M + IR治療后，最顯著改變的代謝途徑是嘌呤代謝(圖9D)。嘌呤及其衍生物廣泛參與生物過程。嘌呤為DNA和RNA提供必需的成分，是器官組織最大的代謝底物。嘌呤也提供了促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖所必需的能量和輔因子。值得注意的是，嘌呤抗代謝物是通過阻斷DNA合成和停止細(xì)胞生長來治療癌癥的最早的抗腫瘤藥物。這一過程解釋了為什么AVPt@HP@M + IR增加了結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中DSB的積累。另外，嘌呤代謝中的嘌呤體可以影響細(xì)胞周期。該過程為AVPt@HP@M + IR治療組中更多G2/M檢查點(diǎn)被激活提供了證據(jù)。

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圖9

邁維代謝TM廣靶檢測(cè)將非靶（高分辨、廣覆蓋）與廣靶（高靈敏、精定量）完美結(jié)合：首先用高分辨TOF對(duì)樣本進(jìn)行二級(jí)譜掃描，提取MRM離子對(duì)信息，再整合廣靶庫構(gòu)建樣本的特異性數(shù)據(jù)庫，最后利用Q-TRAP對(duì)庫中物質(zhì)開展MRM精準(zhǔn)檢測(cè)，極大地提升了有效數(shù)據(jù)量。

技術(shù)優(yōu)勢(shì)

1. 廣泛靶向定位重要常見物質(zhì)；

2. 非靶向挖掘特色功能物質(zhì)（高分辨自建庫、DB-all公共庫、AI預(yù)測(cè)庫、MetDNA2.0）；

3.“MRM模式”黃金定量標(biāo)準(zhǔn)；

4. 通量更大，穩(wěn)定準(zhǔn)確檢出1300+；

5. 尤其適合復(fù)雜樣本。