項(xiàng)目文章 | 轉(zhuǎn)錄組+代謝組助力黑豬肉質(zhì)研究

邁維代謝

2022.2.08

轉(zhuǎn)錄組和代謝組綜合分析揭示恩施黑豬肉質(zhì)復(fù)雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

單位：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)

期刊：Meat Science

隨著生活水平的提高，肉類品質(zhì)已成為動(dòng)物育種的重要目標(biāo)。肉質(zhì)是一個(gè)復(fù)雜的性狀，通過(guò)一系列指標(biāo)來(lái)綜合評(píng)價(jià)，如肉色、肌內(nèi)脂肪含量(IMF)、pH值、持水能力和嫩度。其中，IMF和肉色作為肉質(zhì)的重要指標(biāo)，對(duì)市場(chǎng)管理和育種計(jì)劃具有影響和指導(dǎo)作用。

劣質(zhì)肉類可能會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并增加人類疾病的風(fēng)險(xiǎn)，因此越來(lái)越多的研究旨在闡明脂肪形成和肉類變色的分子機(jī)制。然而，肉品質(zhì)的生物學(xué)和分子機(jī)理的準(zhǔn)確確定仍是一個(gè)挑戰(zhàn)，需要新的方法來(lái)準(zhǔn)確估計(jì)肌內(nèi)脂肪含量和肉色，以提高生產(chǎn)效率。

近年來(lái)，多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析已被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜性狀和病害分析中，以探索其潛在的分子機(jī)制。轉(zhuǎn)錄組和代謝組學(xué)分析已被證明是研究肉質(zhì)性狀的有力工具，有助于通過(guò)多組學(xué)分析更好地了解肌肉調(diào)控機(jī)制。

恩施黑豬是我國(guó)重要的本土豬種，以其肉質(zhì)彈性好、適應(yīng)性強(qiáng)、儲(chǔ)脂能力強(qiáng)等優(yōu)良的生產(chǎn)特性而聞名；但肉質(zhì)的過(guò)度多樣化將嚴(yán)重影響銷售、阻礙產(chǎn)業(yè)擴(kuò)展。為揭示恩施黑豬肉質(zhì)過(guò)度多樣性的潛在分子機(jī)制，本研究對(duì)恩施黑豬的IMF和肉色性狀進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)綜合分析；旨在為恩施黑豬肉質(zhì)遺傳調(diào)控提供理論依據(jù)，為豬肉消費(fèi)食品安全管理提供指導(dǎo)。邁維代謝為本研究提供了代謝組及轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)與聯(lián)合分析。

1. 動(dòng)物材料：99頭恩施黑豬(包括51頭去勢(shì)公豬和48頭母豬) 于260±5日齡采集腰最長(zhǎng)肌樣本進(jìn)行IMF測(cè)定和肉色評(píng)價(jià)、RNA和代謝物提取。

2. IMF(intramuscular fat,肌肉脂肪)和肉色測(cè)量：IMF采用索氏提取法并按照食品中AOAC的官方標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定，IMF < 1.55%的樣品被認(rèn)為是低脂(LF)肉，IMF >為6.30%的樣品被認(rèn)為是高脂(HF)肉；肉色采用美能達(dá)L* a* b*系統(tǒng)參數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)，a*值<11.50的樣品被認(rèn)為是淺色(LC)肉，a*值>15.50的樣品被認(rèn)為是深色(DC)肉。本研究基于IMF和肉色測(cè)量結(jié)果選擇極端樣本：即LF組、LC組、HF組、DC組。

3. RNA測(cè)序& q-PCR分析： IMF組(LF vs HF)和肉色組(LC vs DC)?

4. 代謝組：IMF組(LF、HF組樣本)進(jìn)行動(dòng)物廣泛靶向脂質(zhì)組檢測(cè)；肉色組(LC、DC組樣本)進(jìn)行動(dòng)物廣泛靶向代謝組檢測(cè)。

1、表型分析：篩選IMF組和肉色組極端群體并統(tǒng)計(jì)差異

用于本轉(zhuǎn)錄組和代謝組研究的豬分別具有極端表型的IMF和肉色。根據(jù)IMF記錄，選取5個(gè)HF個(gè)體(3頭去勢(shì)公豬和2頭母豬)和5個(gè)LF個(gè)體(3頭去勢(shì)公豬和2頭母豬)。同樣，選取5個(gè)DC樣品(3頭去勢(shì)公豬和2頭母豬)和5個(gè)LC樣品(2頭去勢(shì)公豬和3頭母豬)進(jìn)行肉色測(cè)定。如圖1A-B,直方圖顯示HF組和LF組間 (mean_HF = 7.38%, SD_HF = 0.009, mean_LF = 1.33%, SD_LF = 0.001, p < 0.01)和DC和LC間(mean_DC = 16.12, SD_DC = 0.72, mean_LC = 10.59, SD_LC = 1.12, p < 0.01) 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2、轉(zhuǎn)錄組分析&qRT-PCR：分別篩選IMF組和肉色組差異基因驗(yàn)證表達(dá)趨勢(shì)并富集功能通路

轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析在IMF和肉色中分別鑒定出120和141個(gè)DEGs，它們?cè)跇O端表型組中的分布如圖1C-D所示：HF組與LF組相比有79個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，41個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；DC組中與LC組相比，有52個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，89個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。熱圖如圖1E-F所示描述了一致的DEGs的表達(dá)模式。在功能性DEGs列表中選取5個(gè)基因(IMF組的PNPLA3和CIDEC ;肉色組的NAMPT、AOX1和BPGM)通過(guò)qRT-PCR進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證 (圖1G)，結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且變化趨勢(shì)與RNA-seq數(shù)據(jù)一致。

圖1.表型和轉(zhuǎn)錄組初步分析 (A) IMF表型比較 (B)肉色表型比較 (C) IMF組DEGs火山圖 (D)肉色組DEGs火山圖 (E) IMF組DEGs聚類熱圖 (F)肉色組DEGs聚類熱圖 (G) RT-PCR檢測(cè)候選DEGs表達(dá)水平

在此基礎(chǔ)上通過(guò)GO分析對(duì)基因進(jìn)行功能注釋和分類(圖2A-B)。GO富集分析表明，富集度最高的GO term主要涉及脂肪相關(guān)代謝，如脂肪酸代謝、一元羧酸代謝和葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)(p < 0.05)。在肉色組研究中顯著富集的GO term主要是細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)節(jié)因子，如細(xì)胞外基質(zhì)、核周期素依賴的蛋白激酶全酶復(fù)合物和蛋白激酶復(fù)合物羧基端結(jié)構(gòu)域(p < 0.05)。為了進(jìn)一步系統(tǒng)地研究表型分化的潛在生物學(xué)意義，基于KEGG生物信息庫(kù)將所鑒定的DEGs注釋到不同的通路中(p < 0.05)。根據(jù)在IMF中鑒定的DEGs，結(jié)果揭示了脂肪酸生物合成過(guò)程、脂肪酸代謝、糖酵解過(guò)程、糖異生活性等多個(gè)富集途徑(圖2C)；肉色組KEGG富集分析還得到了煙酸和煙酰胺代謝過(guò)程、cAMP信號(hào)通路、藥物代謝-細(xì)胞色素P450過(guò)程等重要途徑(圖2D)。

圖2. (A) IMF組DEGs的GO注釋分析柱狀圖 (B)肉色組DEGs的GO注釋分析柱狀圖 (C) IMF組中DEGs的KEGG通路富集示意圖 (D)肉色組DEGs的KEGG通路富集示意圖

3、代謝組分析：篩選顯著變化代謝物及所富集代謝通路

為了研究恩施黑豬肉質(zhì)多樣性代謝產(chǎn)物組成的差異，采用LC-MS/MS對(duì)極端個(gè)體IMF和肉色進(jìn)行分析。PCA和OPLS-DA分析顯示各組間存在明顯區(qū)別。根據(jù)|log2(fold change)|≥1,VIP值≥1篩選SCMs(顯著變化代謝物)。在IMF組共篩選了171個(gè)SCMs：HF組167個(gè)SCMs豐度明顯高于LF組，均屬于二?；视秃腿；视?HF組有4個(gè)SCMs豐度明顯低于LF組。與IMF組相關(guān)的SCMs結(jié)果顯示在火山圖(圖3A)中。肉色組：與LC組的代謝物相比，DC組共有47個(gè)SCMs發(fā)生了明顯的變化，其中39個(gè)代謝物上調(diào)，8個(gè)代謝物下調(diào)（圖3B）。熱圖結(jié)果(圖3C-D)顯示一致。

采用KEGG富集分析以幫助理解與表型變化相關(guān)的生物學(xué)機(jī)制。在IMF中，164個(gè)SCMs被顯著注釋為31個(gè)通路，其中大部分涉及脂肪相關(guān)通路，如膽固醇代謝、脂肪細(xì)胞脂解調(diào)節(jié)、維生素消化吸收、脂肪消化吸收等(p < 0.05;圖3E)。肉色組32個(gè)SCMs主要分為86個(gè)大類，包括谷胱甘肽代謝、鐵下垂和foxO信號(hào)通路(p < 0.05;圖3F)。

圖3. IMF和肉色組代謝組分析 (A) IMF組SCMs火山圖 (B) 肉色組SCMs火山圖 (C) IMF組SCMs的聚類熱圖（TOP60）(D)肉色組SCMs聚類熱圖 (E) IMF組SCMs的KEGG通路富集示意圖 (F) 肉色組SCMs的KEGG通路富集示意圖

4、轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析：構(gòu)建共富集通路挖掘關(guān)鍵差異基因和代謝物

為了探索在轉(zhuǎn)錄組和代謝組數(shù)據(jù)中影響表型多樣性的更多生物學(xué)信息，在這些變化中進(jìn)行了相關(guān)檢驗(yàn)和聯(lián)合生物學(xué)注釋，共包含IMF中鑒定的120個(gè)DEGs(79上調(diào)，41下調(diào))和171個(gè)SCMs(167上調(diào)，4下調(diào))。肉色組中有141個(gè)DEGs(52個(gè)上調(diào)，89個(gè)下調(diào))和47個(gè)SCMs (39個(gè)上調(diào)，8個(gè)下調(diào))。對(duì)這些基因和代謝物、及包含顯著差異基因及其強(qiáng)相關(guān)SCMs進(jìn)行通路注釋，將在IMF或肉色相關(guān)調(diào)控中報(bào)道過(guò)的基因作為性狀相關(guān)候選基因。

脂肪細(xì)胞和肌肉細(xì)胞的肌內(nèi)脂肪代謝：綜上聯(lián)合IMF組的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，差異基因及其強(qiáng)相關(guān)的SCMs被注釋到幾個(gè)重要的通路。

尤其是與肌內(nèi)脂肪代謝相關(guān)的途徑在，與LF組相比HF組的甘油脂代謝途徑聚集了162個(gè)SCMs (6個(gè)二酰基甘油和156個(gè)三?；视?均顯著上調(diào)，同時(shí)該通路中PNPLA3基因（促進(jìn)細(xì)胞脂質(zhì)合成）在HF組中也表現(xiàn)出明顯的上調(diào)；157個(gè)SCMs在脂肪細(xì)胞的脂解調(diào)控途徑中富集，其中156個(gè)SCMs（都是三?；视停┰黾?；因此推測(cè)PNPLA3的活性表達(dá)可能導(dǎo)致甘油三酯的積累，最終通過(guò)調(diào)節(jié)甘油三酯和磷脂酰鏈的生成來(lái)影響IMF的水平。

相應(yīng)篩選定位于脂肪細(xì)胞的脂解調(diào)控途徑的PLIN1和PRKG1基因在HF組與LF組相比時(shí)均過(guò)表達(dá)；其中PLIN1被認(rèn)為是通過(guò)阻止脂滴分解而調(diào)控脂滴形成和三酰甘油水解脂肪脂代謝的重要因子；PRKG1則通過(guò)其他重要的信號(hào)通路注釋（包括產(chǎn)熱作用和長(zhǎng)期抑制）其表達(dá)與IMF中鑒定的36個(gè)SCMs高度相關(guān)(r > 0.7, p < 0.05，圖4A)。

胰島素抵抗被認(rèn)為與體內(nèi)甘油三酯的沉積有關(guān)，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)相關(guān)基因(TRIB3和CREB5)和156個(gè)甘油三酯代謝產(chǎn)物。在此過(guò)程中，TRIB3通過(guò)與Akt激酶結(jié)合阻斷其激活，破壞了在能量代謝和脂肪沉積中起重要作用的胰島素信號(hào)通路；而TRIB3和CREB5的表達(dá)影響肌細(xì)胞中蘇氨酸蛋白激酶的激活和脂肪酸的水平，最終可能促進(jìn)葡萄糖的合成。綜上組合構(gòu)建了相關(guān)途徑網(wǎng)絡(luò)（圖4B）。

圖4. SCMs相關(guān)分析和途徑分析及與IMF性狀相關(guān)差異基因的驗(yàn)證 (A)參與脂質(zhì)代謝的候選基因PRKG1和共表達(dá)SCMs的Cytoscape互作網(wǎng)絡(luò)圖 (B) KEGG通路中富集的5個(gè)核心DEGs和相關(guān)SCMs的脂質(zhì)代謝過(guò)程

煙酸和煙酰胺代謝在調(diào)節(jié)肉色中的作用：肉色研究注釋到DEGs和它們高度相關(guān)的SCMs的重要性狀相關(guān)途徑主要包括煙酸、煙酰胺代謝和谷胱甘肽代謝。將與肉色相關(guān)的3個(gè)DEGs (AOX1, NAMPT和NMNAT2)注釋到煙酸和煙酰胺代謝過(guò)程中，并檢測(cè)到2個(gè)SCMs:煙酸腺嘌呤二核苷酸(NAAD)和В-煙酰胺單核苷酸(NMN)。其中，DC組AOX1明顯升高而NAMPT和NMNAT2降低；在DC組中NAAD和NMN的豐度明顯降低。這些差異基因與代謝物的相關(guān)性如圖5A所示。煙酰胺相關(guān)網(wǎng)絡(luò)如圖5B所示。有報(bào)道稱NMN在代謝調(diào)節(jié)和維持細(xì)胞自我修復(fù)能力方面發(fā)揮著重要作用。煙酰胺可以減少黑素體從黑素細(xì)胞向周圍角化細(xì)胞的轉(zhuǎn)移從而影響皮膚顏色，因此煙酰胺可能通過(guò)類似的代謝機(jī)制改變?nèi)獾念伾?/p>

谷胱甘肽代謝與肉色密切相關(guān)，可能誘發(fā)豬的變色。MGST2基因具有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性，并能通過(guò)影響死后代謝（如ATP消耗和增強(qiáng)蛋白質(zhì)變性）催化谷胱甘肽代謝過(guò)程中的各種谷胱甘肽依賴反應(yīng)，最終對(duì)變色產(chǎn)生影響。MGST2的表達(dá)水平升高，代謝物l -谷氨酸、l -焦谷氨酸、Γ-glutamate-cysteine和甘氨酸含量上調(diào)。

圖5. SCMs相關(guān)性和途徑分析及與肉色性狀相關(guān)差異基因的驗(yàn)證 (A)兩個(gè)核心DEGs和兩個(gè)關(guān)鍵SCMs之間的相關(guān)性 (B)兩個(gè)核心DEGs和兩個(gè)關(guān)鍵SCMs所在煙酸和煙酰胺代謝通路示意圖

本研究基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和LC-MS/MS系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)分析，探討影響IMF和肉色表型的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程。根據(jù)IMF組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行富集分析，揭示了本研究中脂肪生成和分解代謝等脂肪代謝過(guò)程相關(guān)的多條途徑，功能基因PNPLA3、PLIN1、PRKG1、TRIB3、CREB5以及二十烷類和甘油三酯成分在脂質(zhì)代謝相關(guān)過(guò)程中被篩選并顯著富集；在肉色組研究中，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的綜合分析強(qiáng)調(diào)了煙酸、煙酰胺代謝和谷胱甘肽代謝是重要性狀相關(guān)途徑。以上結(jié)果將提供有效的信息和更多的證據(jù)以支持進(jìn)一步深入了解肌內(nèi)脂肪積累和肉色變化的生物學(xué)機(jī)制，研究結(jié)果可在遺傳和分子水平上指導(dǎo)豬肉品質(zhì)的改善。

本研究基于肉質(zhì)的兩個(gè)重要表型指標(biāo)分別選擇了適合的代謝組學(xué)檢測(cè)技術(shù)（廣靶和廣靶脂質(zhì)），進(jìn)一步聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行了相關(guān)性和功能通路雙重分析驗(yàn)證并篩選了與不同指標(biāo)相關(guān)的重要基因和代謝物，思路值得借鑒。