天價(jià)CAR-T細(xì)胞治療有啥副作用？

ProteinSimple

2022.1.07

細(xì)胞治療

? ? ? 顧名思義，是指利用活細(xì)胞進(jìn)行治療，也就是說(shuō)，藥是“活細(xì)胞”。CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T-Cell）療法，作為細(xì)胞治療的一種，截至目前，全球共批準(zhǔn)上市了 6 款 CAR-T 療法產(chǎn)品，價(jià)格昂貴。那么，和其他藥物一樣，是否存在“副作用”，畢竟是藥三分毒......今天，我們來(lái)淺談CAR-T細(xì)胞治療的副作用之一：細(xì)胞因子釋放綜合癥（CRS：Cytokine Release Syndrome）。

CRS產(chǎn)生機(jī)制

細(xì)胞治療過(guò)程中，改良后的CAR-T細(xì)胞，回輸至人體，快速誘導(dǎo)免疫激活，高度增值的T細(xì)胞和各種促炎細(xì)胞因子的超生理水平誘發(fā)（包括IL-1、IL2、IL-6、IL15、IFN-γ、 TNFα,、 Angiopoietin 1&2和GM-CSF等等），可能會(huì)引起CRS，其發(fā)生率為42-100%，0-46%的患者在輸注CAR-T細(xì)胞后出現(xiàn)嚴(yán)重的CRS。臨床表現(xiàn)為發(fā)熱，肌痛和乏力。并可發(fā)展為危及生命的休克，低氧和毛細(xì)血管滲漏。臨床上對(duì)CRS的衡量，可采用實(shí)驗(yàn)室炎癥標(biāo)志物（C反應(yīng)蛋白、鐵蛋白等等）、兒茶酚胺和細(xì)胞因子等檢測(cè)手段。

圖1. CRS產(chǎn)生機(jī)制

CAR-T細(xì)胞的激活和靶細(xì)胞焦亡：根源因素

CAR-T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞相遇后，宿主旁觀(guān)者細(xì)胞（例如，巨噬細(xì)胞）被激活，導(dǎo)致細(xì)胞因子穩(wěn)態(tài)失衡。大量細(xì)胞因子引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞激活，導(dǎo)致與CRS相關(guān)的全身癥狀。識(shí)別腫瘤抗原后，CAR-T細(xì)胞釋放大量穿孔素/顆粒酶和細(xì)胞因子，包括TNF-α和IFN-γ，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞焦亡（Pyroptosis）。

腫瘤細(xì)胞焦亡與細(xì)胞凋亡（Apoptosis）不同，其特點(diǎn)是細(xì)胞腫脹、裂解和之后的細(xì)胞內(nèi)容物與促炎癥因子釋放。細(xì)胞焦亡被視為CRS的開(kāi)始，由顆粒酶B（GZMB）和顆粒酶A（GZMA）介導(dǎo)的兩條通路可能參與其中。GZMA和GZMB都可以通過(guò)穿孔蛋白形成的孔隙進(jìn)入細(xì)胞。隨后，GZMB直接或通過(guò)激活Caspase-3裂解焦孔素E（Gasdermin E：GSDME）。GZMA直接裂解焦孔素B（Gasdermin B：GSDMB），使其活化。被C端掩蓋的Gasdermin的N域可以被釋放，并在細(xì)胞膜上寡聚形成孔隙，導(dǎo)致細(xì)胞活力下降，氣泡從質(zhì)膜吹出，細(xì)胞腫脹，最終導(dǎo)致細(xì)胞裂解。

巨噬細(xì)胞激活：關(guān)鍵調(diào)節(jié)

越來(lái)越多的研究表明，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是與CRS有關(guān)的炎癥細(xì)胞因子的主要來(lái)源。巨噬細(xì)胞可被損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）激活，包括，高遷移率族蛋白-1（HMGB1）、5′-三磷酸腺苷（ATP）和雙鏈DNA（dsDNA）。它們是腫瘤細(xì)胞焦亡的產(chǎn)物。

HMGB1能與巨噬細(xì)胞表面的Toll樣受體2（TLR2）和TLR4結(jié)合。之后，適配蛋白、骨髓分化出反應(yīng)蛋白88（MyD88）和含TIR域的適配蛋白，誘導(dǎo)IFNβ（TRIF）招募，并激活絲裂原激活蛋白激酶（MAPKs）和IκB激酶（IKK）。MAPKs和IKK通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1（AP-1）和核因子κB（NF-κB）調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的釋放，包括IL-6和IL-1β。

ATP被巨噬細(xì)胞上的P2X7受體識(shí)別，可誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)中的NOD-、LRR-和Pyrin域蛋白3（NLRP3）激活，并招募與凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)蛋白（ASC）和Pro-Caspase-1形成NLRP3 炎癥小體，隨后導(dǎo)致Caspase-1的成熟。一方面，Caspase-1負(fù)責(zé)pro-IL-1β裂解和IL-1β的分泌；另一方面，Caspase-1將焦孔素D活化，并導(dǎo)致巨噬細(xì)胞焦亡。焦化的巨噬細(xì)胞因此產(chǎn)生更多的DAMPs和促炎因子，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的進(jìn)一步激活。

dsDNA介導(dǎo)的黑色素瘤2（AIM2）炎癥小體通路缺失，可能參與了Caspase-1的形成。巨噬細(xì)胞吞噬由焦亡的腫瘤細(xì)胞釋放出的dsDNA，并激活細(xì)胞質(zhì)中的AIM2炎癥小體，它是一個(gè)dsDNA傳感器。與NLRP3炎癥小體通路類(lèi)似，激活的AIM2形成AIM2/ASC-Pro-Caspase-1復(fù)合物，觸發(fā)Caspase-1依賴(lài)的IL-1β成熟，從而導(dǎo)致CRS加重。

除了 "焦亡-DAMPs-巨噬細(xì)胞 "模式外，巨噬細(xì)胞還可以被CAR-T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子招募和激活，例如TNF-α、IL-2、GM-CSF和IFN-γ。CAR-T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間的接觸，CD40配體（CD40L）與CD40的相互作用，也可能在觸發(fā)IL-6和IL-1的釋放和誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（iNOS）的表達(dá)發(fā)揮作用。iNOS刺激 NO 的產(chǎn)生，導(dǎo)致血管擴(kuò)張和血流動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定，這是CRS常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)之一。

另外，CAR-T細(xì)胞和惡性細(xì)胞共培養(yǎng)后會(huì)產(chǎn)生兒茶酚胺，也可能參與細(xì)胞因子的釋放。通過(guò)結(jié)合巨噬細(xì)胞表面的α1-腎上腺素受體（AR），兒茶酚胺可以增強(qiáng)AIM2/ASC-Caspase-1途徑，并進(jìn)一步促進(jìn)IL-1β的產(chǎn)生和巨噬細(xì)胞的焦化。此外，兒茶酚胺會(huì)在巨噬細(xì)胞中形成一個(gè)自我放大的前饋環(huán)路，進(jìn)一步促進(jìn)兒茶酚胺、IL-6和其他細(xì)胞因子的釋放，包括巨噬細(xì)胞炎癥蛋白（MIP）-1α、IFN-γ、IL-2和TNF。單核細(xì)胞也可能是CRS中IL-6和IL-1的關(guān)鍵介質(zhì)和主要來(lái)源，曾有報(bào)道，在CAR-T細(xì)胞治療前去除單核細(xì)胞，可以保護(hù)小鼠免受致命CRS的傷害。

IL-6和內(nèi)皮細(xì)胞的激活：核心途徑

在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子中，包括IL-6、IL-1、IL-2、TNF-α、GM-CSF 和IFN-γ，IL-6起著核心作用。值得注意的是。除了巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞外，樹(shù)突狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，甚至是CAR-T細(xì)胞都被認(rèn)為參與了IL-6的產(chǎn)生。IL-6主要通過(guò)與膜結(jié)合IL-6受體（mIL-6R）（經(jīng)典信號(hào)傳導(dǎo)）或sIL-6R（反式信號(hào)傳導(dǎo)）和另一種膜蛋白gp130結(jié)合，來(lái)激活其下游的Janus激酶（JAK）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)劑和轉(zhuǎn)錄激活劑3（STAT3）。gp130廣泛表達(dá)，而mIL-6R主要在肝細(xì)胞和免疫細(xì)胞中表達(dá)。不表達(dá)mIL-6R的細(xì)胞，例如，內(nèi)皮細(xì)胞，被反式信號(hào)傳導(dǎo)激活，其中IL-6與sIL-6R結(jié)合并在血清中形成復(fù)合物，引發(fā)細(xì)胞膜上gp130的二聚化。

因此，被激活的內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)分泌額外的IL-6和其他促炎癥因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、IL-8、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）和凝血酶原激活劑抑制劑-1（PAI-1），導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放和炎癥反應(yīng)放大的正向循環(huán)。

此外，內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)受到細(xì)胞因子損傷，導(dǎo)致血管通透性和滲漏增加、水腫、器官灌注不足、凝血病和器官功能障礙。

細(xì)胞因子檢測(cè)

連續(xù)監(jiān)測(cè)CAR-T細(xì)胞治療輸注前后，患者的細(xì)胞因子動(dòng)態(tài)變化水平有什么重要意義呢？來(lái)自美國(guó)佛羅里達(dá)H. Lee Moffitt癌癥中心的科學(xué)家，在一個(gè)由75名大B細(xì)胞淋巴瘤患者的隊(duì)列中，確定使患者處于嚴(yán)重毒性或治療相關(guān)死亡的高風(fēng)險(xiǎn)因素，這些患者均接受了CD19靶向CAR -T細(xì)胞產(chǎn)品（Yescarta：Axicabtagene Ciloleucel）的治療。來(lái)自Kite Pharma的Yescartata已于2021年3月，被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)上市。

在清除淋巴細(xì)胞的化療（Lymphodepleting Chemotherapy）前，CAR-T輸注當(dāng)天，以及患者住院期間每天測(cè)量血清細(xì)胞因子（GM-CSF, IL1β, IL2, IL6, IL15, IFNγ, TNFα, 和Angiopoietin 1&2均利用ProteinSimple品牌全自動(dòng)ELISA檢測(cè)平臺(tái)Ella檢出）和兒茶酚胺水平。

此處應(yīng)有廣告：我的英文名叫Ella，中文名叫全自動(dòng)微流控ELISA檢測(cè)平臺(tái)，我來(lái)自ProteinSimple，我能解放你的雙手，讓你體會(huì)到什么叫“放縱的滋味”。我人如其名，用過(guò)的都“愛(ài)啦”。

圖2. 細(xì)胞因子檢測(cè)

研究發(fā)現(xiàn)，治療前的IL-6水平與危及生命的CRS之間存在關(guān)聯(lián)。即促炎癥狀態(tài)和不利的腫瘤微環(huán)境（TME）預(yù)先使患者暴露在CAR-T細(xì)胞治療后相關(guān)的免疫毒性風(fēng)險(xiǎn)中。需要根據(jù)患者的風(fēng)險(xiǎn)來(lái)制定毒性管理策略，從而降低發(fā)病率和死亡率。

正如本文通訊作者H. Lee Moffitt癌癥中心醫(yī)學(xué)主任Marco Davila博士所說(shuō)，“在治療前確定哪些患者在接受CAR-T細(xì)胞治療后可能更容易出現(xiàn)嚴(yán)重的毒副作用，可以讓我們更好地定制針對(duì)他們的治療方案，以緩解或減少這些不良反應(yīng)?！?/p>

因此，在深入了解CRS的發(fā)生機(jī)制，知道在CAR-T輸注前IL-6水平與治療后的免疫毒性高度相關(guān)，我們即可提前利用藥物進(jìn)行干預(yù)。例如，使用托珠單抗（抗IL-6R抗體）等藥物阻斷IL-6R，降低CAR-T治療后的免疫毒性風(fēng)險(xiǎn)，將“副作用”扼殺在萌芽。

圖3. 針對(duì)CAR-T相關(guān)毒性治療方案

參考文獻(xiàn)：

1.?Faramand, Rawan et al. “Tumor Microenvironment Composition and Severe Cytokine Release Syndrome (CRS) Influence Toxicity in Patients with Large B-Cell Lymphoma Treated with Axicabtagene Ciloleucel.”?Clinical Cancer Research, 2020.

2.?Siegler, Elizabeth L, and Saad S Kenderian. “Neurotoxicity and Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy: Insights Into Mechanisms and Novel Therapies.”?Frontiers in Immunology,?2020.

3.?Xiao, Xinyi et al. “Mechanisms of cytokine release syndrome and neurotoxicity of CAR T-cell therapy and associated prevention and management strategies.”?Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 2021.

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