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開年封面文章 | 蛋白組學(xué)與代謝組學(xué)“聯(lián)手”發(fā)現(xiàn)糖尿病腎?。―KD）標(biāo)志物！
●?前言
2021年11月，南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院江蘇省中醫(yī)院單位（一作劉史佳研究員）及其課題組在Molecular Metabolism期刊發(fā)表的題為“Serum integrative omics reveals the landscape of human diabetic kidney disease”的研究成果，通過TMT標(biāo)記定量蛋白組學(xué)和GC-MS非靶代謝組學(xué)研究方法，發(fā)現(xiàn)了糖尿病腎病（DKD）特征，篩選了蛋白和代謝組合生物標(biāo)志物。為優(yōu)化糖尿病腎病（DKD）管理提供了豐富且開放訪問的數(shù)據(jù)資源。
? 圖?|?封面文章
中文標(biāo)題：血清綜合組學(xué)揭示人類糖尿病腎病情況
研究對象：人血清
發(fā)表期刊：Molecular Metabolism
影響因子：7.422
發(fā)表時(shí)間：2021年11月1日
合作單位：江蘇省中醫(yī)院
運(yùn)用生物技術(shù)：TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)、GC-MS非靶向代謝組學(xué)(其中部分工作由歐易/鹿明生物提供技術(shù)支持)、ELISA
●?研究背景
糖尿?。―M）影響了全球約4.63億人，而且這一數(shù)字還在繼續(xù)增長。糖尿病不僅會造成器官損傷，還會導(dǎo)致多種并發(fā)癥，糖尿病腎病（DKD）就是常見的糖尿病并發(fā)癥之一?，F(xiàn)在，糖尿病腎?。―KD）已經(jīng)超過腎小球腎炎，成為導(dǎo)致慢性腎臟疾?。–KD)和終末期腎?。‥SRD）的主要原因。雖然已有研究涉及該鄰域，但對糖尿病腎?。―KD）的發(fā)病機(jī)制了解得并不完善，同時(shí)現(xiàn)有的診斷方式（僅根據(jù)臨床信息）并不能準(zhǔn)確地幫助醫(yī)生區(qū)分真正的糖尿病腎病（DKD），非糖尿病腎病以及復(fù)雜型糖尿病腎病。與基因組學(xué)相比，蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)有可能為DKD的進(jìn)展機(jī)制提供新見解。并且結(jié)合這兩種組學(xué)來篩選標(biāo)志物可能可以提高DKD診斷的準(zhǔn)確性。
●?研究思路
●?研究結(jié)果
1.?蛋白質(zhì)組學(xué)破譯DKD在2-DM（二型糖尿病）中的進(jìn)展
每組隨機(jī)選30個(gè)血清樣本，10個(gè)同組樣本混合成一個(gè)上樣樣本，總共檢測了12個(gè)上樣樣本（4組）。原數(shù)據(jù)經(jīng)過預(yù)處理和缺失值過濾后，使用581種蛋白質(zhì)進(jìn)行后續(xù)分析。獨(dú)創(chuàng)性通路分析（IPA）表明，差異蛋白參與了肝臟X受體/類視黃醇X受體（LXR / RXR）激活，法尼體X受體/類視黃醇X受體（FXR / RXR）激活和急性期反應(yīng)信號傳導(dǎo)。
通過ELISA在發(fā)現(xiàn)隊(duì)列的88名參與者的實(shí)驗(yàn)來測試這些蛋白能否區(qū)分DKD程度，驗(yàn)證了8種主要蛋白：脂聯(lián)素、α2-巨球蛋白（α2-M）、組織蛋白酶D、CD324、脂肪酸結(jié)合蛋白1（FABP1）、磷脂轉(zhuǎn)移蛋白（PLTP）、性激素結(jié)合球蛋白（SHBG）和組織抑制劑基質(zhì)金屬蛋白酶1（TIMP-1），偏最小二乘判別分析（PLS-DA）結(jié)果顯示，這8種蛋白可以區(qū)分四個(gè)分組。再通過機(jī)器學(xué)習(xí)算法，發(fā)現(xiàn)α2-M，組織蛋白酶D和CD324可作為潛在的生物標(biāo)志物組合。但準(zhǔn)確區(qū)分2-DM和DKD-E仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。
圖1 | 蛋白質(zhì)組學(xué)破譯了DKD的狀態(tài)
（A） 從參與者那收集蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的工作途徑。
（B） 來自蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的生物標(biāo)志物檢測熱圖。每行代表一個(gè)蛋白質(zhì)標(biāo)記物，每列代表四組（包括HC，2-DM，DKD-E和DKD-A）的上樣樣品。蛋白質(zhì)標(biāo)記物通過分層聚類分為四個(gè)簇。
（C–F）對應(yīng)于所示四個(gè)簇的蛋白表達(dá)圖 1B.這四個(gè)集群分別呈現(xiàn)出下行、上平、上行和下行模式。
（G–K）每個(gè)成對比較的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的火山圖。x軸是 log2 折疊變化，y軸表示減對數(shù) 10 p值。過度表達(dá)和表達(dá)不足的蛋白質(zhì)分別標(biāo)有紅色和藍(lán)色。
（L） 網(wǎng)絡(luò)圖，說明差異表達(dá)蛋白檢測到的富集通路。每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一種蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)通過其所涉及的途徑連接。
（M） 基于ELISA標(biāo)記的偏最小二乘判別分析。
（N） 小提琴圖通過ELISA說明了每組α2-巨球蛋白、組織蛋白酶D和CD324的濃度。
2.血清中差異表達(dá)代謝物的成對比較? ?
使用GC-MS非靶向代謝組學(xué)對發(fā)現(xiàn)隊(duì)列的1102名參與者的代謝物進(jìn)行分析，總共鑒定到207種代謝物。對差異代謝物進(jìn)行了非參數(shù)Wilcoxon檢驗(yàn)，并且對排名靠前的上調(diào)和下調(diào)代謝物分析，鑒定到乳酸、甘油-3-半乳糖苷、內(nèi)消旋赤蘚糖醇、D-（+）-木糖、甘油和（+-）3-甲基-2-氧代戊酸。對它們進(jìn)行PLS回歸分析，發(fā)現(xiàn)它們可以有效地分離比較組。
對每個(gè)比較組種差異代謝物進(jìn)行通路分析，來確定這些代謝物在2型糖尿病和DKD中的生物學(xué)意義。分析表明甘油脂代謝、戊糖和葡萄糖醛酸鹽相互轉(zhuǎn)化以及半乳糖代謝是受影響最大的途徑。
圖2 | 通過成對比較DKD狀態(tài)來檢測差異表達(dá)的代謝物
（A–E）顯著上調(diào)代謝物的代表性箱形圖。
（F–J）顯著下調(diào)代謝物的代表性箱形圖。
（K–O）基于差異表達(dá)代謝物的偏最小二乘判別分析。
（P–T）根據(jù)差異表達(dá)的代謝物涉及最重要的重要功能途徑。
3.血清中差異代謝物相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)
為了研究代謝物的改變對DKD不同階段的影響，進(jìn)行了通路和相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析。根據(jù)差異代謝物在不同組中的中位表達(dá)，把它們可以分為兩類：第一類是在HC、2-DM和DKD-E中表達(dá)量相對低；另一類是在DKD-A中相對表達(dá)量低。使用PLS-DA進(jìn)一步分析，四個(gè)組能很好地被分開。通路分析表示，戊糖和葡萄糖醛酸鹽相互轉(zhuǎn)化、半乳糖代謝和甘油脂代謝排在前面。網(wǎng)絡(luò)分析表明與2-DM和DKD發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵代謝物（如甘油，半乳糖等）在四組中發(fā)生了顯著變化。
圖3 | DKD代謝物生物標(biāo)志物鑒定
（A） 差異表達(dá)代謝物的分層聚類。熱圖中現(xiàn)實(shí)的每組代謝物的中位表達(dá)水平。
（B） 四個(gè)組的偏最小二乘判別分析。
（C） 由差異表達(dá)代謝物檢測到的重要途徑。
（D） 基于差異表達(dá)代謝物的網(wǎng)絡(luò)分析。
4.通過血清中代謝物的表達(dá)成對地預(yù)測DKD的機(jī)器學(xué)習(xí)
使用五種機(jī)器學(xué)習(xí)算法（LDA,SVM,RF,Logi和偏最小二乘判別分析），生成的ROC曲線顯示HC與2-DM、HC與DKD-E、HC與DKD-A、2-DM與DKD-A、DKD-E與DKD-A的預(yù)測精度分別為75%、82%、93%、90%和84%（圖4A-E）。
然后在內(nèi)部隊(duì)列和三個(gè)外部測試集中進(jìn)行驗(yàn)證，不同比較組的模型在不同測試隊(duì)列中不同，有些隊(duì)列的準(zhǔn)確性比較低。與蛋白標(biāo)志物一樣，代謝物不能很好地區(qū)分2-DM和DKD-E。根據(jù)6個(gè)臨床數(shù)據(jù)，可將2-DE分為5個(gè)亞型，重新分組了參與者，發(fā)現(xiàn)血清代謝物在五組中顯示出明顯地特征?？偟膩碚f，這些代謝物可以預(yù)測2-DM和DKD狀態(tài)，特別是早期和晚期狀態(tài)。
圖4 | 通過代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的機(jī)器學(xué)習(xí)算法預(yù)測DKD狀態(tài)
（A–E）通過五種不同的機(jī)器學(xué)習(xí)方法對每個(gè)接收器的工作特性（ROC）曲線進(jìn)行成對預(yù)測。
（F–J）通過隨機(jī)森林雜質(zhì)測量選擇的主要預(yù)測特征。
（K–O）基于隨機(jī)森林算法的預(yù)測概率。
5.蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的整合提高了DKD的診斷價(jià)值
作者進(jìn)行了綜合分析，將蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)中的顯著生物標(biāo)志物合并到通路分析中，并確定了半乳糖代謝、戊糖和葡萄糖醛酸鹽相互轉(zhuǎn)化、檸檬酸鹽循環(huán)和丙酮酸代謝這幾種途徑。然后結(jié)合蛋白質(zhì)和代謝標(biāo)志物來預(yù)測DKD狀態(tài)。五種機(jī)器學(xué)習(xí)模型表明，組合模型提高了DKD預(yù)測的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。圖中展示了RF的結(jié)果。總的來說，組合多組學(xué)標(biāo)志物模型是一種強(qiáng)有力的提高DKD診斷的方法。
圖5 | 蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的綜合分析
（A） 差異表達(dá)的蛋白質(zhì)和代謝物檢測到的重要途徑。
（B） 成對預(yù)測精度基于僅蛋白質(zhì)特征（藍(lán)色）、僅代謝物特征（紅色）以及蛋白質(zhì)和代謝物特征整合（橙色）。
（C） 熱圖為預(yù)測精度。熱圖像元中的數(shù)字表示真實(shí)情況與預(yù)測事例的比率。
（D） 當(dāng)整合ELISA和代謝物特征時(shí)，隨機(jī)森林模型對所有發(fā)現(xiàn)隊(duì)列訓(xùn)練的預(yù)測樹。
（E） 基于隨機(jī)森林算法的雜質(zhì)測量對ELISA和代謝物特征進(jìn)行排名。
（F） 在整合 ELISA 和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)時(shí)，基于五種機(jī)器學(xué)習(xí)算法區(qū)分 2-DM 和 DKD-E 的預(yù)測精度。
6.甘油-3-半乳糖苷是檢測DKD發(fā)展的生物標(biāo)志物
通過分析差異表達(dá)的代謝物和每個(gè)患者的臨床參數(shù)之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)血清甘油-3-半乳糖苷與患者的eGFR和血清肌酐相關(guān)，還發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)可能是DKD發(fā)展的血清標(biāo)志物。甘油-3-半乳糖苷的合成過程如圖所示，結(jié)合其他研究討論了它可能在DKD中的機(jī)制。綜合數(shù)據(jù)表明血清蛋白α2-M/組織蛋白酶D/CD324和甘油-3-半乳糖苷的變化可能是確定DKD發(fā)病和進(jìn)展的有效生物標(biāo)志物。
圖6 | 甘油-3-半乳糖苷的合成是DKD進(jìn)程中一個(gè)獨(dú)立的代謝事件
（A–-B）甘油-3-半乳糖苷與eGFR或血清肌酐（Scr）水平之間的相關(guān)性。
（C）示意圖描述了甘油-3-半乳糖苷的合成過程及其在DKD發(fā)病中的作用。
● 研究結(jié)論
該研究一共從4個(gè)獨(dú)立的醫(yī)療中心招募了1513名參與者，包括健康成年人（HC）、2-DM、早期糖尿病腎?。―KD-E)和晚期糖尿病腎?。―KD-A），并建立了一個(gè)發(fā)現(xiàn)隊(duì)列和四個(gè)測試隊(duì)列?？偟膩碚f，通過對參與者的血清進(jìn)行蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)研究主要得出三個(gè)結(jié)果：
1. 蛋白組學(xué)結(jié)果表明，α2-巨球蛋白、組織蛋白酶 D 和 CD324可作為檢測DKD進(jìn)展的潛在生物標(biāo)志物。
2. 代謝組學(xué)結(jié)果表明，半乳糖代謝和甘油脂代謝是DKD的主要代謝途徑，此外甘油-3-半乳糖苷可作為預(yù)測DKD的獨(dú)立標(biāo)志物。
3. 蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)的組合可以提高預(yù)測和診斷DKD的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。
血清綜合組學(xué)的生物標(biāo)志物可用于DKD的預(yù)警和診斷。該研究為優(yōu)化DKD的管理提供了數(shù)據(jù)資源。
小鹿推薦
通過TMT標(biāo)記蛋白組學(xué)和GC-MS非靶代謝組學(xué)研究健康組和不同程度患病組的差異，找到可能影響疾病或者改變的生物途徑。找到的差異代蛋白質(zhì)和代謝物可作為疾病診斷的生物標(biāo)志物，單獨(dú)的生物標(biāo)志物診斷效果往往有限，多組學(xué)多指標(biāo)組成的綜合型標(biāo)志物可以很好的提高診斷效果。為臨床的診斷和疾病的管理提供一種強(qiáng)有力的方法。
一作簡介
劉史佳 研究員
劉史佳，博士，研究員，南京中醫(yī)藥大學(xué)副教授，碩導(dǎo)，江蘇省中醫(yī)院藥學(xué)部副主任，美國芝加哥IIT研究所和南京大學(xué)博士后。主要從事中藥質(zhì)量和臨床藥理學(xué)研究。近年來主持國家自然基金等省部級以上科研項(xiàng)目10余項(xiàng)。承擔(dān)完成新藥臨床試驗(yàn)項(xiàng)目20多項(xiàng)，獲新藥批件4項(xiàng)。發(fā)表學(xué)術(shù)論文116篇，以第一或通訊作者發(fā)表學(xué)術(shù)論文58篇（包括Basic Research in Cardiolog、Molecular Metabolism、Frontiers in Immunology、Rheumatology等SCI論文33篇，單篇影響因子最高17.17）。申請國家發(fā)明專利27項(xiàng)，已授權(quán)11項(xiàng)，20項(xiàng)為第一發(fā)明人，PCT和歐洲專利各1項(xiàng)。參與編寫專著4部。獲得教育部科技進(jìn)步二等獎等省部級以上表彰獎勵(lì)3項(xiàng)。國家藥監(jiān)局新藥評審現(xiàn)場核查專家、江蘇省藥品化妝品醫(yī)療器械安全應(yīng)急管理專家。國家中醫(yī)藥管理局全國中醫(yī)藥創(chuàng)新骨干人才、中華中醫(yī)藥學(xué)會托舉工程青年人才，江蘇省“333工程”中青年科學(xué)技術(shù)領(lǐng)軍人才，江蘇省“六大人才高峰”高層次人才、江蘇省政府青年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)人才、第四屆江蘇省中醫(yī)藥十佳青年之星。江蘇省藥師協(xié)會臨床研究藥師分會副主任委員、江蘇省藥理學(xué)會臨床藥理專委會理事兼秘書長、中國藥理學(xué)會抗炎免疫藥理專委會常務(wù)委員等。
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