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干貨—以qPCR方法為例談?wù)劶毎委煍?shù)據(jù)分析方法驗證（下篇）
? ? ? ?細胞治療與基因治療行業(yè)目前正在蓬勃發(fā)展，每個新藥走上臨床都需要經(jīng)過IND申報，在進行IND申報則必須要對產(chǎn)品質(zhì)量控制的檢測方法進行開發(fā)和驗證，不論是委托第三方檢測，還是獨立完成，都需要根據(jù)藥典完成以下幾個項目的驗證：準確度、精密度（包括重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性）、專屬性、檢測限、定量限、線性、范圍和耐用性。由于分析方法具有各自的特點，并隨分析對象而變化，因此需要視具體情況擬訂驗證的指標。
? ? ? ? 以qPCR方法為例，上篇說到了專屬性、準確度和精密度的驗證，接下來看看另外幾個指標的驗證：
? ? ? ?1、檢測限（DetectionLimit，LOD）
? ? ? ?檢測限是指試樣在確定的實驗條件下，被測物能被檢測出的最低濃度或含量。它是限度檢驗效能指標，無需定量測定，只要指出高于或低于該規(guī)定濃度即可。
? ? ? ?對于qPCR定量方法來說，一般選擇線性范圍低濃度樣本進行檢測，以滿足重復(fù)性但是不滿足準確度標準的最低濃度作為檢測限；?
? ? ? ?2、定量限（QuantitationLimit，LOQ）
? ? ? ?定量限是指樣品中被測物能被準確定量測定的最低量，結(jié)果應(yīng)具有一定準確度和精密度要求。對于qPCR定量方法來說，一般選擇線性范圍低濃度樣本進行檢測，以能夠同時滿足重復(fù)性和準確度標準的最低濃度作為定量限；
? ? ? ?3、線性（Linearity）
? ? ? ?線性系指在設(shè)計的范圍內(nèi)，測定響應(yīng)值或其經(jīng)數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)化的形式與試樣中被測物濃度直接呈比例關(guān)系的程度。
? ? ? ?應(yīng)在設(shè)計的范圍內(nèi)測定線性關(guān)系?？捎猛粚φ掌焚A備液經(jīng)精密稀釋，或分別精密稱取對照品，制備一系列對照品溶液的方法進行測定，至少制備5種不同濃度的供試樣品。線性數(shù)據(jù)要求：至少需要五個濃度考察線性，需提供相關(guān)系數(shù)（R2）、 y截距（是檢定的可能偏差）、回歸斜率及方差等參數(shù)，應(yīng)列出回歸方程數(shù)和線性圖。
? ? ? ?上圖為2020版中國藥典三部3407 外源性DNA殘留量測定法中，對于qPCR方法進行驗證的數(shù)據(jù)要求。
? ? ? ?使用qPCR方法進行絕對定量的檢測項目，例如宿主DNA殘留檢測時，這一類雜質(zhì)屬于越少越好，在質(zhì)量控制中希望線性范圍更廣，檢測限和定量限更低，對于所使用的的定量PCR儀的線性范圍和靈敏度也提出了要求。
? ? ? ? 4、范圍（Range）
? ? ? ? 范圍系指分析方法能達到精密度、準確度和線性要求時的高低限濃度或量的區(qū)間。范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用及其線性、準確度、精密度結(jié)果和要求確定。
? ? ? ? 對于使用qPCR方法進行定性的檢測項目中，比如支原體檢測，對檢測范圍和檢測限的要求需要更為嚴格，避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果，這點對于儀器的靈敏度就提出了要求。
? ? ? ?5、耐用性（Robustness）
? ? ? ?耐用性又稱粗放度，系指在測定條件有小的變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度，為所建立的方法用于常規(guī)檢驗提供依據(jù)。
? ? ? ?德國耶拿定量 PCR 儀在外源性宿主 DNA 殘留檢測方面有很多的實際應(yīng)用案例，客戶的使用體驗反饋有：
l??儀器檢測靈敏度高
l? 實驗數(shù)據(jù)的重復(fù)性好
l? 運行速度快
l? 中文軟件很好用
l? 儀器運行很安靜
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