干貨—以qPCR方法為例談?wù)劶?xì)胞治療數(shù)據(jù)分析方法驗(yàn)證（上篇）

德國耶拿生命科學(xué)部

2021.11.05

? ? ? ?細(xì)胞治療與基因治療行業(yè)目前正在蓬勃發(fā)展，每個新藥走上臨床都需要經(jīng)過IND申報(bào)，在進(jìn)行IND申報(bào)則必須要對產(chǎn)品質(zhì)量控制的檢測方法進(jìn)行開發(fā)和驗(yàn)證，不論是委托第三方檢測，還是獨(dú)立完成，都需要根據(jù)2020藥典標(biāo)準(zhǔn)完成以下幾個項(xiàng)目的驗(yàn)證：專屬性、準(zhǔn)確度、精密度（包括重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性）、檢測限、定量限、線性、范圍和耐用性。由于分析方法具有各自的特點(diǎn)，并隨分析對象而變化，因此需要視具體情況擬訂驗(yàn)證的指標(biāo)。

? ? ? ?我們以qPCR方法為例，來聊一聊如何設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)獲得數(shù)據(jù)完成這些驗(yàn)證項(xiàng)目。

? ? ? ?1、專屬性Specificity

? ? ? ?專屬性是指在其他成分（如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等）可能存在下，采用的分析方法能正確測定出被測物的能力。如方法專屬性不強(qiáng)，應(yīng)采用多種不同原理的方法予以補(bǔ)充。

? ? ? ?鑒別反應(yīng)、雜質(zhì)檢査和含量測定方法，均應(yīng)考察其專屬性。

? ? ?? 對于qPCR方法來說，需要設(shè)置陰性對照，陽性對照，空白對照，在陰性對照和空白對照無Ct值，陽性對照有效擴(kuò)增的情況下，方才認(rèn)定專屬性成立；

? ? ? ??2、準(zhǔn)確度Accuracy

? ? ? ?準(zhǔn)確度是指用該方法測定的結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近的程度，一般用回收率（%）表示。測定回收率R（recovery）的具體方法可采用“回收試驗(yàn)法”和“加樣回收試驗(yàn)法”。

? ? ? 根據(jù)準(zhǔn)確度數(shù)據(jù)要求，有兩種方案。

? ? ? 第一種在線性范圍內(nèi)，取同一濃度（相當(dāng)于100%濃度水平）的供試品，用至少6份樣品的測定結(jié)果計(jì)算回收率進(jìn)行評價。

? ? ? 第二種方案在線性范圍內(nèi)，設(shè)計(jì)高中低3種不同濃度，每種濃度分別制備3份供試品進(jìn)行測定，用至少9份樣品的測定結(jié)果進(jìn)行評價。

? ? ? 兩種方法的選定應(yīng)考慮分析的目的和樣品的濃度范圍。對于有關(guān)物質(zhì)檢查的準(zhǔn)確度，還需對定量限水平的準(zhǔn)確度進(jìn)行評價。

? ? ? 對于qPCR方法來說，準(zhǔn)確度的要求一般為回收率50~150%；這一驗(yàn)證項(xiàng)目里，可能出現(xiàn)挑戰(zhàn)的在于低濃度樣本，因此需要一個靈敏度高，數(shù)據(jù)重復(fù)性好的儀器來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

??? ? ?3、精密度Precision（包括重復(fù)性Repeatability、中間精密度Intermediateprecision和重現(xiàn)性Reproducibility）

? ? ? ?重復(fù)性是指在相同條件下，由同一個分析人員測定所得結(jié)果的精密度。

（如上圖所示，左邊的圖精密度良好，但是準(zhǔn)確度不符合要求；右邊的圖平均值的準(zhǔn)確度符合要求，但是精密度較差）?

? ? ? 重復(fù)性數(shù)據(jù)要求：在規(guī)定范圍內(nèi)，取至少6份同一濃度（分析方法擬定的樣品測定濃度，相當(dāng)于100%濃度水平）的供試品，即實(shí)測樣品，進(jìn)行評價；或根據(jù)線性范圍，設(shè)計(jì)3種不同濃度，每種濃度分別制備3份供試品進(jìn)行測定，用至少9份樣品的測定結(jié)果進(jìn)行評價。

? ? ? 注意，對于qPCR方法來說，這6份樣品或9份樣品需要在同一次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。

? ? ? 中間精密度是指在同一個實(shí)驗(yàn)室，不同時間由不同分析人員用不同設(shè)備測定結(jié)果之間的精密度。中間精密度是考察隨機(jī)變動因素對精密度的影響，注意控制變量，每次只能驗(yàn)證一個項(xiàng)目。

? ? ? 重現(xiàn)性是指在不同實(shí)驗(yàn)室由不同分析人員測定結(jié)果之間的精密度。在分析方法從研發(fā)實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)到QC實(shí)驗(yàn)室的過程中，通常會進(jìn)行重現(xiàn)性的考察。

? ? ??含量測定和雜質(zhì)的定量測定都需要考察方法的精密度。

? ? ?精密度數(shù)據(jù)要求：對于qPCR方法，需要提供相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，計(jì)算公式如下，樣品中待測定成分含量和精密度RSD可接受范圍請參考ChP2021版中9101中可接受范圍表。