疏水層析替代反相層析在核酸藥物純化工藝中的應(yīng)用

東曹分離與純化

2021.3.19

核酸藥物是繼抗體藥之后備受市場期待的下一代生物藥物。目前全球已有12種核酸藥物獲批上市，預(yù)計(jì)今后每年將會有3～4種核酸藥物獲批。作為主流核酸藥物的合成寡核苷酸，在經(jīng)過固相法或液相法的化學(xué)合成工藝后，通過反相層析（RPC）或離子交換層析（IEC）等方法進(jìn)行分離和純化。

但是，普通RPC工藝無法完全去除目標(biāo)產(chǎn)物中的相關(guān)雜質(zhì)，而且由于大量使用有機(jī)溶劑，需要進(jìn)行廢液處理、配備防爆設(shè)備等，會產(chǎn)生對成本控制不利等因素。因此，相關(guān)人員正在研究使用可代替RPC的層析工藝——疏水層析。

與RPC相比，疏水層析的優(yōu)勢？

● 可以去除固相合成時(shí)從固相導(dǎo)出的樣品溶液中含有的氫氧化銨等低分子。

● 合成過程中，保護(hù)基二甲氧三苯甲基 (DMT) 與目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合的DMT-on目標(biāo)物，與保護(hù)基脫落生成的DMT-off雜質(zhì)更容易被分離。

● 可以分離目標(biāo)產(chǎn)物的相關(guān)雜質(zhì)，即N-1雜質(zhì)、N+1雜質(zhì)、P=0雜質(zhì)、氰乙基化 (CNEt) 雜質(zhì)、無堿基雜質(zhì)等。

● 使用酸性洗脫液，可在柱內(nèi)完成目標(biāo)產(chǎn)物的脫三苯甲基化?(DMT基團(tuán)的脫保護(hù)) 。

● 聚合物基質(zhì)的填料可使用堿性溶液 (pH13以下)，還可用NaOH溶液對層析柱進(jìn)行CIP清洗。

● 由于洗脫液幾乎不使用有機(jī)溶劑，所以無需配備防爆設(shè)備，還可減少廢液處理的費(fèi)用。

合成寡核苷酸的純化精制工藝示例

疏水層析填料分離合成寡核苷酸的實(shí)例

以下實(shí)例中使用了東曹公司的4種疏水填料對粗純的寡核苷酸進(jìn)行分離。

從上述各種類型的HIC填料分離粗純的寡核苷酸的結(jié)果來看，DMT-off雜質(zhì)在所有的HIC填料上均無法被吸附，而是直接流穿。另外，從目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫位置、與雜質(zhì)的分離度來看，TOYOPEARL Phenyl-650M和Butyl-650M這兩款填料更適用于寡核苷酸的純化。

使用疏水填料分離合成寡核苷酸時(shí)，柱內(nèi)DMT基的脫保護(hù)處理

使用TOYOPEARL Phenyl-650M進(jìn)行分離時(shí)，色譜柱進(jìn)樣、吸附粗純的寡核苷酸 (DMT-on目標(biāo)物) 樣品后，先通過淋洗去除樣品中DMT-off雜質(zhì)。然后，在洗脫液中加入50 mmol/L醋酸、1 mol/L硫酸銨溶液，在柱內(nèi)對目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行DMT基的脫保護(hù) (脫三苯甲基反應(yīng)) 處理，從而獲得脫三苯甲基DMT-off的最終目標(biāo)產(chǎn)物。

另外，脫保護(hù)的DMT基團(tuán)會吸附在色譜柱上，在CIP階段 (用蒸餾水和30%的異丙醇清洗) 被洗脫去除。經(jīng)此純化，目標(biāo)產(chǎn)物的回收率為99%，RPC-HPLC檢測純度達(dá)99%以上。由此證明，寡核苷酸可以使用HIC填料進(jìn)行有效精制。

參考文獻(xiàn)：

1)??Hybridon Inc., Patent WO 96/01268(1996)

2)? K. Ruanjaikaen et al., presentation by BioProcess International West(2017),San Francisco, USA

3)? Biogen MA Inc., Patent WO 2017/218454 A1(2017)

AJICAP位點(diǎn)特異性抗體藥物偶聯(lián)物的疏水純化策略陰離子交換色譜法快速分析質(zhì)粒拓?fù)洚悩?gòu)體兩步層析法平臺，降低單克隆抗體下游純化工藝成本東曹色譜產(chǎn)品在病毒載體分析與分離純化中的應(yīng)用抗體藥物偶聯(lián)物（ADC）的DAR分析表征

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