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中藥注射劑評(píng)價(jià)特色分析方案丨LCMSMS測(cè)定注射劑對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中組胺含量
l類過敏反應(yīng)
類過敏反應(yīng)是中藥注射劑臨床應(yīng)用過敏反應(yīng)常見類型，是非經(jīng)典途徑的免疫反應(yīng)，其主要機(jī)制是細(xì)胞受到外界物質(zhì)刺激發(fā)生反應(yīng)后分泌組胺、蛋白酶和花生四烯酸等過敏性介質(zhì)。組胺則是過敏反應(yīng)中最主要的活性過敏介質(zhì)之一，可導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生潮紅、頭痛、水腫、低血壓以及休克等癥狀。通過中藥注射劑對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液反應(yīng)，檢測(cè)組胺等過敏介質(zhì)的含量，對(duì)判斷中藥注射劑發(fā)生類過敏的風(fēng)險(xiǎn)具有一定的應(yīng)用價(jià)值。
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l組胺檢測(cè)方法
由于生物樣品中組胺的含量低，量化組胺需要高靈敏度的分析方法。目前，組胺的檢測(cè)方法主要有 ELISA 檢測(cè)法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、氣相色譜和離子色譜法等。
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l分析條件
液相條件
HILIC色譜柱(2.1 mm I.D.x150 mm L.3 um)
流動(dòng)相：A 相 -20mM 乙酸銨 +0.1% 甲酸水溶液 ?B相-乙腈
流速：0.4 mL/min
柱溫：40℃
進(jìn)樣量：5 μL
洗脫方式：等度洗脫，A:B=10:90(V/V)
質(zhì)譜條件
離子化模式：ESI,正離子模式
離子噴霧電壓：+4.5 kV
霧化氣流速：氮?dú)?/span> 3.0 L/min
干燥氣流速：氮?dú)?/span> 15 L/min
碰撞氣：氬氣
加熱模塊溫度：400℃
掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)
駐留時(shí)間：50 ms
延遲時(shí)間：3 ms
DL管溫度：250℃
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MRM優(yōu)化參數(shù)
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l樣品的處理
取培養(yǎng)一段時(shí)間后的細(xì)胞培養(yǎng)液，注射入中藥注射試劑刺激細(xì)胞后取細(xì)胞上清液，并在 0~4℃以3000 r/min 離心10 min，取上清液至進(jìn)樣小瓶中，從中取 100 μL 至另一離心管中加入 20 μL內(nèi)標(biāo)溶液，加入200 μL乙腈，充分挑勻室溫 15000 rpm,15 min 再次離心。取 100 μL 上清液加入 900 μL超純水充分振勻后直接上樣分析。
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l分析結(jié)果
標(biāo)樣的MRM色譜圖（10ng/mL）
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線性關(guān)系
組胺校準(zhǔn)曲線
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重復(fù)性實(shí)驗(yàn)
配制目標(biāo)物濃度分別為 1、10、100 ng/mL 的混合標(biāo)樣，平行測(cè)定各3次，考察儀器的重復(fù)性，保留時(shí)間和峰面積重復(fù)性結(jié)果如下表所示，儀器重復(fù)性良好。
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回收率及精密度實(shí)驗(yàn)
稱取組胺標(biāo)準(zhǔn)品，以陰性細(xì)胞上清液溶解，使其質(zhì)量濃度為1、10、100 ng/mL，按 前述“0~4℃以3000 r/min 離心10 min……取 100 μL 上清液加入 900 μL超純水充分振勻后直接上樣分析?！碧幚砗?，對(duì)樣品進(jìn)行3個(gè)加標(biāo)水平的回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定3次， 3 個(gè)加標(biāo)水平的平均回收率為 90.4%~93.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 4.75%~5.78%。結(jié)果表明方法的回收率和精密度均較好。
LC-MS/MS測(cè)定中藥注射劑對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液組胺含量的分析方法，方法穩(wěn)定、特異性和靈敏度均較高，重復(fù)性好。因此，本方法可用于測(cè)定中藥注射劑對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中組胺含量，對(duì)判斷中藥注射劑發(fā)生過敏的風(fēng)險(xiǎn)具有一定的應(yīng)用價(jià)值。
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