神經(jīng)分析方案革新：無標(biāo)記自動化高通量活細(xì)胞神經(jīng)生長動力學(xué)評價

2024.9.14

體外神經(jīng)突生長分析是神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域非常重要的實(shí)驗(yàn)方法，主要用于評估神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能，在神經(jīng)相關(guān)疾病研究、模型建立和藥物評價領(lǐng)域應(yīng)用廣泛?，F(xiàn)有的評價方案多基于特定的神經(jīng)細(xì)胞熒光標(biāo)記，抑或由于設(shè)備限制，無法開展神經(jīng)細(xì)胞生命周期的全時程監(jiān)測。

安捷倫 BioTek 近期推出了全新神經(jīng)細(xì)胞分析軟件模塊，搭載經(jīng)典的 Cytation&BioSpa8 高通量活細(xì)胞成像平臺，可輕松幫助研究者獲得?Label Free?的神經(jīng)突生長動力學(xué)分析結(jié)果。

Cytation 成像平臺的?Label Free?技術(shù)優(yōu)勢

無標(biāo)記成像技術(shù)提供了一種在活細(xì)胞中評估神經(jīng)生長的最精簡操作方案，相較之下，由于必須證明熒光標(biāo)記物不會干擾研究中的生物過程，用于活細(xì)胞分析的熒光模型需要大量的開發(fā)和驗(yàn)證投入。相反，無標(biāo)記方法能夠立即適用于各種樣本類型，包括那些不適宜進(jìn)行熒光操作的樣本。此外，使用無標(biāo)記方法也可以很好的避免熒光成像可能造成的細(xì)胞毒性和光毒性效應(yīng)。

安捷倫 Cytation5&7 成像平臺具有獨(dú)特設(shè)計的無標(biāo)記成像硬件模塊，能夠提供三種不同的無標(biāo)記成像模式：無標(biāo)記明場、無標(biāo)記高對比度明場及無標(biāo)記相差成像。三種成像模式為不同的樣本類型提供高質(zhì)量的無標(biāo)記細(xì)胞圖像。本文中展示了明場及相差模式獲得神經(jīng)細(xì)胞的無標(biāo)記圖像，搭載 BioSpa8 智能培養(yǎng)箱，可自動化開展多通量的活細(xì)胞無標(biāo)記圖像采集。

圖 1：Cytation 成像系統(tǒng)的三種不同的無標(biāo)記成像模式

主要實(shí)驗(yàn)流程

本文采用 iPSCs 誘導(dǎo)的皮質(zhì)神經(jīng)元（iCell GlutaNeurons）模型，細(xì)胞接種于 96 孔板后，設(shè)置總長度為 5 天的 BioSpa8 培養(yǎng)流程，其中前24小時細(xì)胞貼壁生長，隨后進(jìn)行第一次 50% 培養(yǎng)基換液及給藥，培養(yǎng)至 48 小時完成第二次培養(yǎng)基換液及給藥。最后通過 BioSpa8 程序自動完成后續(xù)的神經(jīng)生長調(diào)節(jié)劑評價檢測。實(shí)驗(yàn)流圖示意圖如下：

圖 2：無標(biāo)記自動化高通量活細(xì)胞神經(jīng)生長評價實(shí)驗(yàn)流程

無標(biāo)記神經(jīng)細(xì)胞基礎(chǔ)生長動態(tài)評價結(jié)果

在藥物評價之前，先對神經(jīng)細(xì)胞的基礎(chǔ)生長進(jìn)行準(zhǔn)確評估。

在這個實(shí)驗(yàn)方案中，初次拍攝采用 3h 拍照間隔，連續(xù)采集 120 小時，采用 Gen5 軟件識別神經(jīng)細(xì)胞的總長度用于評價神經(jīng)細(xì)胞生長情況。比較有趣的是，結(jié)果發(fā)現(xiàn)起始拍照點(diǎn)和三小時后的第二個時間點(diǎn)的神經(jīng)生長有較大的跳躍（圖3C,D），為了探究這個現(xiàn)象，前 6 個小時采用更為密集的拍攝間隔(10min)，用于獲得精準(zhǔn)的神經(jīng)細(xì)胞生長曲線。結(jié)果顯示，在培養(yǎng)的前三個小時內(nèi)，iCell GlutaNeurons 表現(xiàn)出快速和持續(xù)的生長增加。對培養(yǎng)前 3 小時神經(jīng)突平均生長長度進(jìn)行 Gen5 分析，結(jié)果顯示每個細(xì)胞的生長速率為~ 500 μm/天(圖 3F)。在早期快速生長期之后，神經(jīng)元過渡到慢速生長階段(15 μm/天，圖 3D)。

圖 3：無標(biāo)記神經(jīng)元基礎(chǔ)生長分析。A，20x 相差成像及軟件識別；B，20X 明場成像及軟件識別。C，相差及明場神經(jīng)突總長度動力學(xué)分析數(shù)據(jù)。D，24 小時 - 120 小時神經(jīng)突平均長度線性擬合用于分析平均生長速度。E，拍攝間隔 10 分鐘，總拍攝長度 6 小時的神經(jīng)突生長曲線。F，對前 3 小時的神經(jīng)突平均長度進(jìn)行線性擬合用于分析神經(jīng)元生長速率。

無標(biāo)記神經(jīng)突分析用于評價藥物作用效果

神經(jīng)元生長曲線分析結(jié)果可用于幫助選擇給藥時間點(diǎn)，本方案中選擇神經(jīng)細(xì)胞種板后的 24-48 小時完成給藥，在 96 孔板上評價了 4 種不同的神經(jīng)生長調(diào)節(jié)劑的作用效果，包括 Blebbistatin（布比他?。?、6BIO（公藤甲素）、triptolide（雷公藤內(nèi)酯）和 Staurosporine（星形孢菌素），每種藥物設(shè)置 3 個濃度梯度。本分析方案中，能夠獲得每種藥物對神經(jīng)元突起總長度（圖 4）、平均突起長度和神經(jīng)突數(shù)量的定量結(jié)果（圖 5），并且 Gen5 的動力學(xué)曲線分析能夠獲得每種藥物的促神經(jīng)生長時間窗口、高濃度細(xì)胞抑制時間窗口、平均治療后反應(yīng)時間等參數(shù)（圖 5）。

圖 4：四種不同的神經(jīng)調(diào)節(jié)劑對 iCell GlutaNeurons 的生長作用效果的動態(tài)評價。評價指標(biāo)：神經(jīng)突總長度，成像模式：20X相差。A：Staurosporine（星形孢菌素）B：Blebbistatin（布比他?。〤：6BIO（公藤甲素）D：triptolide（雷公藤內(nèi)酯）。

圖 5：平均神經(jīng)突長度和單細(xì)胞神經(jīng)突分支數(shù)動力學(xué)分析結(jié)果用于確定每種藥物的治療反應(yīng)時間。

最后，通過在 Gen5 軟件中計算動力學(xué)成像過程最后 12 小時的神經(jīng)分析參數(shù)的平均值，可以獲得每種藥物的劑量 - 反應(yīng)曲線（圖 6），以下結(jié)果展示了總神經(jīng)突長度、平均神經(jīng)突長度、單細(xì)胞神經(jīng)突分支數(shù)三種不同評價指標(biāo)獲得的藥物劑量效應(yīng)曲線。