詳細解析實時熒光定量PCR探針法技術原理
目前主流的實時熒光定量PCR?（Quantitative Real-time PCR）方法分為染料法和探針法，染料法以SYBR Green法為代表，SYBR Green染料游離時熒光微弱，但但一旦與雙鏈DNA結合后，熒光大大增強，反應管中的熒光強度與反應管中雙鏈DNA的數量成正比例關系，因此熒光定量pcr實驗步驟可以通過檢測熒光計算反應管中產生的雙鏈DNA（PCR產物）的量，但該方法沒有特異性，非特異性擴增的產物也會被計入。
? ? 對于探針法來說，反應管中的熒光強度也是檢測PCR產物量的依據。但其發(fā)光機制卻與染料法完全不同。
? ? 一、熒光
? ? 是指一種光致發(fā)光的冷發(fā)光現象。當某種常溫物質經某種波長的入射光照射，吸收光能后進入激發(fā)態(tài)，并且立即退激發(fā)并發(fā)出比入射光的波長長的出射光。
? ? 其原理為：光照射到某些原子時，光的能量使原子核周圍的一些電子由原來的軌道躍遷到了能量更高的軌道，即從基態(tài)躍遷到第一激發(fā)單線態(tài)或第二激發(fā)單線態(tài)等。第一激發(fā)單線態(tài)或第二激發(fā)單線態(tài)等是不穩(wěn)定的，所以會恢復基態(tài)，當電子由第一激發(fā)單線態(tài)恢復到基態(tài)時，能量會以光的形式釋放，所以產生熒光。
? ? （紫外驗鈔的原理就是利用了經漂白處理后的紙張在紫外線(波長為365nm的藍光)的照射下會衍射出波長為420460nm的藍光
? ? 二、熒光共振能量轉移fluorescence resonance energy transfer(FRET)
? ? 熒光物質間存在一種現象，如果一個熒光基團（稱為供體Donor）的發(fā)射光譜與另一個基團（受體 Acceptor）的吸收光譜有一定的重疊，當二者的距離接近到一定程度（1-10nm）供體被激發(fā)光激發(fā)但是卻不發(fā)出該物質的發(fā)射光，而是將能量轉移至受體，整個能量轉移的過程中由一對偶極子介導，不涉及光子的發(fā)射和重新吸收。如果受體熒光量子產率為零，則發(fā)生能量轉移熒光熄滅（即供體熒光被受體淬滅）；如果受體也是一種熒光發(fā)射體，則呈現出受體的熒光，并造成次級熒光光譜的紅移。
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? ? 三、qPCR探針法的本質
? ? 目前所有的探針法qPCR的理論基礎都是利用了熒光共振能量轉移現象，探針上存在一對能產生熒光共振能量轉移的基團，利用PCR反應中的一些過程（酶切，雜交等），使兩個基團的距離產生變化，使系統(tǒng)中的熒光強度或者熒光種類發(fā)生變化，這種變化又與PCR產物的種類和量有直接關系，通過檢測這種變化，我們就可以檢測出PCR反應體系中產物的種類和量。
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? ? 四、幾種qPCR探針法
? ? 1、Taq-Man探針：Taq-Man探針法是最經典的探針方法，設計一條與擴增產物能互補雜交的探針，在探針的5’端標記熒光基團（供體），在探針3’端標記淬滅基團（受體），當探針完整時，熒光基團和淬滅基團距離很近（探針長度）因熒光共振能量轉移，熒光基團在入射光激發(fā)下不發(fā)出熒光。PCR反應進行時，探針雜交在擴增產物上，當引物介導的延伸反應到達探針位置時，因taq酶擁有5’-3’的外切酶活性，會從5‘端切割（水解）探針，從而使5’端的熒光基團和3’端的淬滅基團分離，使它們的間距超過10nm，超出熒光共振能量轉移的范圍，熒光基團此時在合適入射光的作用下，就能發(fā)出自身波長的熒光。探針雜交是特異性的，所以熒光的種類和量能特異性的代表目標產物的種類和量。
? ? 近年來對Taq-Man探針進行改良發(fā)展出TaqMan-MGB探針， 在Taq-Man探針的3端加入一個能插入DNA小溝的二氫環(huán)化吲哚卟啉-三肽（DPI3），可以使大大提高探針的TM值，增加雜交反應的特異性。
? ? 2、雙雜交探針（dual hybridization probe）：與Taq-Man法不同，雙雜交探針的供體基團和受體基團分別在兩條探針上，這兩條探針都可以與擴增產物雜交，雜交位置不同但很接近，反應時兩條探針一頭一尾雜交于擴增產物上，雜交后兩個基團距離在10nm以內（一般1-5堿基），此時產生熒光共振能量轉移現象，激發(fā)光下供體基團不發(fā)光，受體基團發(fā)光，檢測受體基團的發(fā)光情況既可以確認擴增產物的情況。
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? ? 3、分子信標探針（molecular beacon，MB）：分子信標探針采用的是在反應中增加熒光基團和淬滅基團距離的方法，和Taq-Man法不同，分子信標探針不是采用酶切的方式使熒光基團和淬滅基團分離，而是通過雜交的方式改變探針二級結構，增加兩個基團的距離從而使熒光基團發(fā)光。
? ? 分子信標探針在與靶序列雜交前呈現一個莖環(huán)結構，其中環(huán)部分為能與靶序列互補雜交的特異性序列，臂部分互補，熒光基團和淬滅基團分別在兩臂的末端，當分子信標探針呈莖環(huán)狀態(tài)時，熒光基團和淬滅基團距離極近，熒光基團被淬滅。
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? ? 分子信標探針結構
? ? 當PCR擴增反應產生靶序列產物，探針環(huán)部分與靶序列發(fā)生雜交，兩臂距離因此拉開，兩個基團間的距離不能形成熒光共振能量轉移，熒光基團發(fā)光。
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? ? 4、蝎形探針（scorpion）：蝎形探針又叫蝎形引物，因形狀類似蝎子而得名，其基本原理與分子信標探針十分類似，不同點在于，蝎形探針3’端帶了PCR引物，反應中得到的產物與蝎形探針為一個分子，探針的雜交在分子內部，而不需要兩個分子參與，從而使雜交反應更加迅速，高效。
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