核酸pcr步驟
一、個(gè)人三級防護(hù)穿戴
帶一次性帽子、佩戴醫(yī)用N95、一次性防護(hù)服、一次性鞋套、一次性防水靴套、一層乳膠手套、外層一次性隔離衣、防護(hù)目鏡、第二層乳膠手套、穿戴完畢后應(yīng)盡快通過專用緩沖間或者走廊，進(jìn)入核酸提取區(qū)（專業(yè)核酸提取實(shí)驗(yàn)室）。
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二、樣本滅活處理
核酸檢測須有兩名工作人員快速通過進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行滅活實(shí)驗(yàn)操作。生物安全柜內(nèi)需配備吸水棉與消毒酒精、有條件可配備吸水臺布，對樣本溢灑時(shí)進(jìn)行緊急處理；打開二級容器，用75%酒精消毒物體表面，檢測樣本管密閉性后進(jìn)行滅活處理，滅活條件（56℃，30min，恒溫樣本滅菌儀等多種方式），取出酒精滅活管用酒精擦拭外表，將樣本放入到生物安全柜內(nèi)。
三、手工核酸提取
操作人員進(jìn)入試劑配置區(qū)或者單獨(dú)的潔凈實(shí)驗(yàn)室。
一、試劑區(qū)準(zhǔn)備
根據(jù)說明說要求，在AW1中加入無水乙醇130mL，在AW2中加入無水乙醇160mL，計(jì)入無水乙醇后及時(shí)做好標(biāo)記，在310μg的Carrier RNA中加入310μL AVE，并顛倒混勻使Carrier RNA充分溶解，就此完成洗液AW1、洗液AW2和Carrier RNA配置，而后通過傳遞窗傳送到樣本處理區(qū)，或者由專人送到核酸提取實(shí)驗(yàn)室中。
二、樣本的裂解
用1.5ml的無菌EP管，移液器移取560μl AVL裂解液，加入5.6μl Carrier RNA，加入140μl的已滅活的待提取核酸的待測樣本，渦旋振蕩15s，室溫靜止10min。將上述EP管放入離心機(jī)內(nèi)瞬時(shí)離心以去除可能殘留在EP管蓋上的裂解產(chǎn)物，防止污染。裂解完成后，加入560μl無水乙醇，振蕩混勻15s，將上述EP管放入離心機(jī)內(nèi)瞬時(shí)離心以去除可能殘留在EP管蓋上的裂解產(chǎn)物，防止污染。
向離心柱加入裂解產(chǎn)物630μl，8000轉(zhuǎn)離心1min，若離心機(jī)在生物安全柜之外，每次使用都需進(jìn)行外表面消毒。更換新廢液收集管，要從離心機(jī)中小心取出離心柱，將上層離心柱轉(zhuǎn)移到新收集管中，繼續(xù)將剩余裂解產(chǎn)物630μl加入離心柱中，若樣本體積大于140μl時(shí)需重復(fù)此步驟，直到全部裂解產(chǎn)物都過柱離心，8000轉(zhuǎn)離心1min，小心將離心柱轉(zhuǎn)移到新的收集管中。
取500μl AW1加入離心柱中（注意，此處加樣操作時(shí)務(wù)必將移液器吸頭接觸離心柱內(nèi)壁緩慢加樣），8000轉(zhuǎn)離心1min。小心取出離心柱，更換新的收集管。
取500μl AW2加入離心柱中，14000轉(zhuǎn)離心3min，小心取出離心柱，更換新的離心柱上端收集管，置于離心機(jī)中使用最大轉(zhuǎn)速離心1min，以確保將AW2中的殘液完全離心干凈。
取無菌1.5mlEP管收集核酸，將離心柱上端小心放入1.5mlEP管中，取40-60μl的洗脫液AVE加入到離心柱中（注意：洗脫液應(yīng)盡量全部覆蓋住離心柱膜），用EP管管蓋蓋住離心柱，使用無菌剪刀剪去原離心柱管蓋。
室溫靜止1min，將其放入離心機(jī)中8000轉(zhuǎn)離心1min，回收核酸。丟棄離心柱，EP管中即為獲取的提取核酸，做好標(biāo)記與登記。
四、用儀器提取核酸
首先按照說明說準(zhǔn)備核酸提取試劑，將200μl滅活樣本添加到核酸提取試劑中，根據(jù)核酸提取儀的設(shè)置程序上機(jī)提取核酸，等儀器操作結(jié)束，提取核酸完成，回收核酸。
五、PCR體系配置
根據(jù)檢測樣本數(shù)量配制體系，將配制好的PCR體系充分混勻并離心后，將其通過傳遞窗送至樣本處理核酸加樣區(qū)，或單獨(dú)的樣本加樣實(shí)驗(yàn)室。按照每孔分裝20μL反應(yīng)體系，進(jìn)行分裝，在各孔分別加入5μL待測樣本核酸或陰陽對照物（請注意每次檢測器包含1個(gè)陽性對照和3個(gè)陰性對照且陰性對照需隨機(jī)分布），密封PCR管，有條件時(shí)模板加樣盡量在單獨(dú)的生物安全柜進(jìn)行。
工作人員將配好的PCR管通過傳送窗口送至PCR擴(kuò)增區(qū)，或由專人送至PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室，上機(jī)檢測。
六、上機(jī)檢測及結(jié)果分析
工作人員進(jìn)入基因擴(kuò)增分析實(shí)驗(yàn)室，從傳遞窗取出PCR反應(yīng)管，上機(jī)前需混勻并離心反應(yīng)體系，按試劑盒說明說設(shè)置擴(kuò)增參數(shù)并分析判讀結(jié)果。分析結(jié)果時(shí)，嚴(yán)格閱讀說明說充分了解試劑盒靈敏度、方法學(xué)局限性等綜合判讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
為防止擴(kuò)增污染，反應(yīng)結(jié)束后的PCR擴(kuò)增管嚴(yán)禁開蓋并裝入密封帶中裝入指定的垃圾桶中。
七、檢測后的消毒處理
樣本處理完成后，工作人員應(yīng)用75%的酒精消毒處理外層手套并脫下外層手套，放入生物安全柜中的生物垃圾桶中。檢測完成后，生物安全柜臺面和地面應(yīng)用0.5-1%的有效氯消毒劑或75%乙醇進(jìn)行擦拭。將安全柜內(nèi)產(chǎn)生的醫(yī)療垃圾用三層垃圾袋密封，并將其放入指定垃圾桶中，垃圾袋上需標(biāo)記醫(yī)療垃圾信息。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，生物安全柜以及實(shí)驗(yàn)室均要進(jìn)行紫外燈照射消毒，時(shí)間至少30min。
實(shí)驗(yàn)操作人員，應(yīng)有他人用0.5-1%的有效氯消毒劑或75%乙醇對一次性隔離衣均勻噴霧消毒處理，而后脫去隔離衣將檢測醫(yī)用垃圾放入制定垃圾桶中，工作人員在離開二級實(shí)驗(yàn)室后，應(yīng)在緩沖區(qū)或走廊按順序摘脫個(gè)人三級防護(hù)用品，首先應(yīng)帶新的外層手套，摘掉護(hù)目鏡并置于75%乙醇中消毒，自上而下、自內(nèi)向外翻轉(zhuǎn)脫掉一次性防護(hù)服，脫去外層手套，摘除、一次性帽子、脫一次性鞋套。脫掉手套，病毒防護(hù)服均需進(jìn)行高壓滅菌處理。高壓前后醫(yī)療垃圾嚴(yán)格區(qū)分。
病毒相關(guān)垃圾需在120度，30min條件進(jìn)行濕熱高壓處理，以高壓試紙條變色為有效，而后作為普通醫(yī)療垃圾處理。
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