wb封閉液用水溶解對(duì)結(jié)果影響
WB實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)
一、蛋白樣品的制備
按組織凈重(g)：裂解液體積(ml)=1：10的比例加入相應(yīng)體積的裂解液(加入終濃度為1mM的PMSF、適當(dāng)濃度的蛋白酶抑制劑和磷酸化酶抑制劑，以避免內(nèi)源性酶分解蛋白，影響蛋白質(zhì)的抽提)進(jìn)行勻漿。
蛋白質(zhì)的樣品制備是westemblotting的第一步，也是關(guān)鍵步驟，要想獲得所有蛋白質(zhì)，應(yīng)注意以下問題：
(1)在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性；
(2)選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價(jià)二硫鍵，使其形成各自多肽的溶液；
(3)盡量去除核酸，多糖，脂類等分子的干擾，在裂解完畢離心之后小心取中層澄清溶液，注意不要吸到底層沉淀和上層脂類；
(4)防止蛋白在處理過程中的人為修飾，制備過程必須在低溫下進(jìn)行，以避免細(xì)胞破碎釋放出各種酶類的修飾。(注意：可以適當(dāng)加入PMSF等酶抑制劑)
(5)樣本制備完后分裝保存，但是注意不要反復(fù)凍融。
二、凝膠的制備
30%的PAG配置完后過濾于4C保存，10% SDS室溫保存。AP不穩(wěn)定，用時(shí)現(xiàn)配。（注意：分子量較小的蛋白選用較大濃度的凝膠）
制膠關(guān)鍵是聚合時(shí)間，分離膠聚合控制在從加入10% AP和TEMED至開始凝膠，時(shí)間為10-20min(未完全凝聚)，濃縮膠最佳聚合時(shí)間為8-10min，可通過控制AP和TEMED量來控制。AP和TEMED的量過高，局部膠疑的太快，會(huì)使疑膠不均勻，電泳蛋白條帶會(huì)彎曲。環(huán)境溫度較高時(shí)，應(yīng)減少AP和TEMED的量?？諝庵醒鯕庖矔?huì)影響膠的聚合，所以在分離膠上面應(yīng)加一層水或正丁醇以隔絕氧氣。
三、電泳常見問題
(1)條帶出現(xiàn)微笑現(xiàn)象(中間凹兩邊翹起)：主要是凝膠中間部分凝固不均所致，應(yīng)待凝膠充分凝固后電泳，或者催化劑加入后充分混勻；
(2)條帶出現(xiàn)“皺眉”現(xiàn)象(中間鼓坡兩邊向下)：兩玻璃板之間底部氣泡所致，應(yīng)排除底部氣泡；
(3)帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象：主要是樣本溶解效果不佳，分離膠濃度過大，電泳緩沖液放置時(shí)間過長(zhǎng)。建議：加樣前離心，選擇適當(dāng)?shù)臉颖揪彌_液，加適量的樣品促溶
劑；使用新配置的電泳緩中液，降低凝膠濃度或使用梯度凝膠。
(4)蛋白條帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象：樣品不溶性顆粒引起的。建議：加樣前離心，加入適量的促溶劑。
(5)指示的澳酚藍(lán)已跑出底板，但蛋白質(zhì)未跑下來：與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)應(yīng)更換正確PH值的緩沖液，降低凝膠濃度或使用梯度凝膠
四、轉(zhuǎn)印
濕式電轉(zhuǎn)印注意事項(xiàng)：
(1)要使蛋白質(zhì)組分能有效的從凝膠轉(zhuǎn)移到固相紙膜上，緩沖液的PH值很重要，有些分子量不是很大的蛋白質(zhì)區(qū)帶，即使延長(zhǎng)電轉(zhuǎn)印時(shí)間也不能從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上。這是由于蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)移緩沖液中恰好處于等電點(diǎn)狀態(tài)造成的，因此應(yīng)適當(dāng)改變轉(zhuǎn)移緩沖液的PH，以利于轉(zhuǎn)膜。另外，對(duì)于分子量較小的蛋白質(zhì)，可在緩沖液中加入適量甲醇，因?yàn)榧状寄艽龠M(jìn)它們固定在固相膜上。但是對(duì)于大分子量的蛋白質(zhì)，尤其是堿性蛋白質(zhì)，緩沖液中是不宜加入甲醇的，因?yàn)榧资鼓z孔徑變小，不利于分子量較大的蛋白的轉(zhuǎn)移，甲醇能將結(jié)合在堿性蛋白質(zhì)上的SDS解離出來而使其帶正電或呈電中性蛋白質(zhì)就更難從凝膠中轉(zhuǎn)移出來；
(2)電轉(zhuǎn)印膜的選擇：有NC膜、重氮化膜和陽離子尼龍膜，PVDF膜。其中NC膜使用的最為普遍，它的蛋白質(zhì)容量大，可用各種染色方法進(jìn)行檢測(cè)，但是它與蛋白質(zhì)的結(jié)合是非價(jià)性的，膜干燥后很脆。此外膜的孔徑大小也是考慮的重要因素，目的蛋白30KD以下用0.22 um孔徑的NC膜，30KD以上用0.45 um孔徑的NC膜；
(3)轉(zhuǎn)印選擇恒流，每個(gè)轉(zhuǎn)印槽150 mA，10KD以下轉(zhuǎn)印40min，10-30KD轉(zhuǎn)印50min，30-100KD轉(zhuǎn)印70min，100kd以上轉(zhuǎn)印80min，轉(zhuǎn)印完畢可用麗春紅S染膜檢測(cè)轉(zhuǎn)印是否成功，轉(zhuǎn)印結(jié)束后去除NC膜置于麗春紅S溶液中，室溫5-10min即可看見紅色條帶，用TBS洗數(shù)次即可洗掉紅色條帶進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
五、封閉
(1)電泳轉(zhuǎn)膜過后，膜上其他沒有結(jié)合蛋白質(zhì)的空白位置需要用封閉液加以封閉，以避免一抗或二抗非特異性結(jié)合。這是由于WB的靈敏度很大程度上取決于封閉的好壞，封閉時(shí)間過長(zhǎng)(過度封閉)導(dǎo)致抗原表位的遮蔽，從而降低檢測(cè)靈敏度，封閉時(shí)間過短(不完全封閉)又會(huì)導(dǎo)致最終背景增高或信噪比太低，因此封閉液的選擇和條件的優(yōu)化很重要；
(2)封閉液中應(yīng)加入適量的防腐劑，避免封閉蛋白變性影響封閉效果。
六、抗體的雜交
(1)若非特異性條帶過多，可適當(dāng)降低抗體的濃度，增加洗膜次數(shù)，蛋白電泳前延長(zhǎng)變性時(shí)間，減少上樣蛋白量，延長(zhǎng)封閉時(shí)間；
(2)若信號(hào)弱，可能轉(zhuǎn)膜不完全，可優(yōu)化轉(zhuǎn)移時(shí)間和電流，增加抗體的濃度，適當(dāng)延長(zhǎng)曝光時(shí)間；
(3 )若背景較高，可適當(dāng)降低抗體的濃度，過濾二抗，延長(zhǎng)封閉時(shí)間，增加漂洗時(shí)間，減少曝光時(shí)間。
七、檢測(cè)
(1)膠片曝光幾秒到數(shù)分鐘，具體情況要看膜上化學(xué)發(fā)光條帶明暗強(qiáng)度而定。膠片曝光時(shí)間不宜過長(zhǎng)，時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)照成膠片背景變深。沖洗膠片以確定所測(cè)抗原
的正確曝光時(shí)間；
(2)沖洗膠片的步驟：曝光完的膠片先在顯影液中沖洗至出現(xiàn)條帶為止，一般在1min以內(nèi)，時(shí)間過長(zhǎng)也會(huì)照成膠片背景變深。再放入定影液中漂洗，十秒即可
顯影液漂洗完后，要多用清水沖洗，以免定影液中成分殘留在膠片
