分子雜交技術(shù)的幾種常見的雜交
分子雜交是通過各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性標(biāo)記的探針與被固定的分子雜交，經(jīng)顯影后顯示出目的DNA或RNA分子所處的位置。根據(jù)被測定的對(duì)象，分子雜交基本可分為以下幾大類：
(1) Southern雜交:DNA片段經(jīng)電泳分離后,從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上,然后與探針雜交。被檢對(duì)象為DNA,探針為DNA或RNA。
(2) Northern雜交:RNA片段經(jīng)電泳后,從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上,然后用探針雜交。被檢對(duì)象為RNA,探針為DNA或RNA。
根據(jù)雜交所用的方法,另外還有斑點(diǎn)(dot)雜交、狹槽(slot)雜交和菌落原位雜交等。有3種固相支持體可用于雜交:硝酸纖維素濾膜、尼龍膜和Whatman 541濾紙。不同商標(biāo)的尼龍膜需要進(jìn)行不同的處理，在DNA固定和雜交的過程中要嚴(yán)格按生產(chǎn)廠家的說明書來進(jìn)行。Whatman 541濾紙有很高的濕強(qiáng)度,最早用于篩選細(xì)菌菌落。該濾紙主要用于篩選一些基因文庫。固定化DNA的雜交條件基本與使用硝酸纖維素濾膜時(shí)所建立的條件相同。Whatman 541濾紙與硝酸纖維素濾膜相比有一些優(yōu)點(diǎn):它更便宜,雜交中更耐用,干燥過程中不易變形和碎裂等。然而若變性過程不小心,雜交信號(hào)的強(qiáng)度會(huì)明顯弱于用硝酸纖維素濾膜時(shí)所得到的信號(hào)強(qiáng)度。因此,常規(guī)的細(xì)菌篩選和各種雜交時(shí)仍選用硝酸纖維素濾膜作為固相支持體。 Southern雜交可用來檢測經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后的DNA片段中是否存在與探針同源的序列,它包括下列步驟:
(1) 酶切DNA, 凝膠電泳分離各酶切片段,然后使DNA原位變性。
(2) 將DNA片段轉(zhuǎn)移到固體支持物(硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上。
(3) 預(yù)雜交濾膜,掩蓋濾膜上非特異性位點(diǎn)。
(4) 讓探針與同源DNA片段雜交,然后漂洗除去非特異性結(jié)合的探針。
(5) 通過顯影檢查目的DNA所在的位置。
Southern雜交能否檢出雜交信號(hào)取決于很多因素,包括目的DNA在總DNA中所占的比例、探針的大小和比活性、轉(zhuǎn)移到濾膜上的DNA量以及探針與目的DNA間的配對(duì)情況等。在最佳條件下,放射自顯影曝光數(shù)天后, Southern雜交能很靈敏地檢測出低于0.1pg與32 P標(biāo)記的高比活性探針的(>109 cpm/μg)互補(bǔ)DNA。如果將10μg基因組DNA轉(zhuǎn)移到濾膜上，并與長度為幾百個(gè)核苷酸的探針雜交,曝光過夜,則可檢測出哺乳動(dòng)物基因組中1kb大小的單拷貝序列。
將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移到固體支持物上的方法主要有3種:(1)毛細(xì)管轉(zhuǎn)移。本方法由Southern發(fā)明,故又稱為Southern轉(zhuǎn)移(或印跡)。毛細(xì)管轉(zhuǎn)移方法的優(yōu)點(diǎn)是簡單,不需要用其他儀器。缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)移時(shí)間較長,轉(zhuǎn)移后雜交信號(hào)較弱。(2)電泳轉(zhuǎn)移。將DNA變性后,可電泳轉(zhuǎn)移至帶電荷的尼龍膜上。該法的優(yōu)點(diǎn)是不需要脫嘌呤/水解作用,可直接轉(zhuǎn)移較大的DNA片段。缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)移中電流較大,溫度難以控制。通常只有當(dāng)毛細(xì)管轉(zhuǎn)移和真空轉(zhuǎn)移無效時(shí),才采用電泳轉(zhuǎn)移。(3) 真空轉(zhuǎn)移。有多種真空轉(zhuǎn)移的商品化儀器,它們一般是將硝酸纖維素膜或尼龍膜放在真空室上面的多孔屏上,再將凝膠置于濾膜上,緩沖液從上面的一個(gè)貯液槽中流下,洗脫出凝膠中的DNA,使其沉積在濾膜上。該法的優(yōu)點(diǎn)是快速,在30分鐘內(nèi)就能從正常厚度(4-5mm)和正常瓊脂糖濃度(<1%)的凝膠中定量地轉(zhuǎn)移出來。轉(zhuǎn)移后得到的雜交信號(hào)比Southern轉(zhuǎn)移強(qiáng)2-3倍。缺點(diǎn)是如不小心，會(huì)使凝膠碎裂, 并且在洗膜不嚴(yán)格時(shí),其背景比毛細(xì)轉(zhuǎn)移要高。
1、材料： 待檢測的DNA，已標(biāo)記好的探針。
2、設(shè)備： 電泳儀，電泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自顯影盒，X-光片，雜交袋，硝酸纖維素濾膜或尼龍膜，濾紙。
3、試劑：
(1)10mg/ml 溴化乙錠（EB）。
(2)50×Denhardt's溶液：5g Ficoll-40, 5g PVP, 5g BSA加水至500ml,過濾除菌后于-20℃儲(chǔ)存。
(3)1×BLOTTO:5g脫脂奶粉，0.02%疊氮鈉，儲(chǔ)于4℃。
(4)預(yù)雜交溶液:6×SSC, 5×Denhardt, 0.5% SDS, 100mg/ml鮭魚精子DNA, 50%甲酰胺。
(5)雜交溶液:預(yù)雜交溶液中加入變性探針即為雜交溶液。
(6)0.2mol/L HCl。
(7)0.1% SDS。
(8)0.4mol/L NaOH。
(9)變性溶液:87.75g NaCl, 20.0g NaOH加水至1000ml。
(10)中和溶液:175.5g NaCl, 6.7g Tris·Cl, 加水至1000ml。
(11)硝酸纖維素濾膜。
(12)20×SSC: 3mol/L NaCl, 0.3mol/L檸檬酸鈉,用1mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至7.0;
(13)2×、1×、0.5×、0.25×和0.1×SSC:用20×SSC稀釋。
4、操作步驟：
(1) 約50μl體積中酶切10pg-10μg的DNA, 然后在瓊脂糖凝膠中電泳12-24小時(shí)(包括DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物)。
(2) 500ml水中加入25μl 10mg/ml溴化乙錠,將凝膠放置其中染色30分鐘, 然后照相。
(3) 依次用下列溶液處理凝膠,并輕微搖動(dòng): 500ml 0.2mol/L HCl 10分鐘, 傾去溶液(如果限制性片段>10kb, 酸處理時(shí)間為20分鐘)，用水清洗數(shù)次,傾去溶液; 500ml變性溶液兩次,每次15分鐘,傾去溶液; 500ml中和溶液30分鐘。如果使用尼龍膜雜交，本步可以省略。
(4) 戴上手套,在盤中加20×SSC液,將硝酸纖維素濾膜先用無菌水完全濕透,再用20×SSC浸泡。將硝酸纖維素濾膜一次準(zhǔn)確地蓋在凝膠上,去除氣泡。用浸過20×SSC液的3濾紙蓋住濾膜,然后加上干的3濾紙和干紙巾,根據(jù)DNA復(fù)雜程度轉(zhuǎn)移2-12小時(shí)。當(dāng)使用尼龍膜雜交時(shí)，該膜用水浸潤一次即可，轉(zhuǎn)移時(shí)用0.4mol/L NaOH代替20×SSC。簡單的印跡轉(zhuǎn)移2-3小時(shí),對(duì)于基因組印跡,一般需要較長時(shí)間的轉(zhuǎn)移。
(5) 去除紙巾等,用藍(lán)色圓珠筆在濾膜右上角記下轉(zhuǎn)移日期,做好記號(hào),取出濾膜,在2×SSC中洗5分鐘,涼干后在80℃中烘烤2小時(shí)。注意在使用尼龍膜雜交時(shí)，只能空氣干燥，不得烘烤。
(6) 將濾膜放入含6-10ml預(yù)雜交液的密封小塑料袋中,將預(yù)雜交液加在袋的底部,前后擠壓小袋,使濾膜濕透。在一定溫度下(一般為37-42℃)預(yù)雜交3-12小時(shí)，棄去預(yù)雜交液。
(7) 制備同位素標(biāo)記探針（參見第一節(jié)），探針煮沸變性5分鐘。
(8) 在雜交液中加入探針,混勻。如步驟（6）將混合液注入密封塑料袋中,在與預(yù)雜交相同溫度下雜交6-12小時(shí)。
(9) 取出濾膜,依次用下列溶液處理,并輕輕搖動(dòng): 在室溫下, 1×SSC/0.1% SDS, 15分鐘, 兩次。 在雜交溫度下, 0.25×SSC/0.1% SDS, 15分鐘, 兩次。
(10) 空氣干燥硝酸纖維素濾膜,然后在X光片上曝光。通常曝光1-2天后可見DNA譜帶。對(duì)于≥108 cpm/μg從缺口平移所得探針,可很容易地從10μg哺乳DNA中檢測到10pg的單拷貝基因。 Northern雜交與Southern雜交很相似。主要區(qū)別是被檢測對(duì)象為RNA,其電泳在變性條件下進(jìn)行,以去除RNA中的二級(jí)結(jié)構(gòu),保證RNA完全按分子大小分離。變性電泳主要有3種:乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳和羥甲基汞變性電泳。電泳后的瓊脂糖凝膠用與Southern轉(zhuǎn)移相同的方法將RNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上,然后與探針雜交。
1、材料：待檢測的RNA及制備好的探針。
2、設(shè)備：電泳儀，電泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自顯影盒，X-光片，雜交袋，硝酸纖維素膜或尼龍膜。
3、試劑：
(1)20×SSPE:175.3g NaCl, 88.2g檸檬酸鈉，溶于800ml水中，用10mol/LNaOH調(diào)pH至7.4，定溶到1L。
(2)其他試劑：與Southern雜交試劑類似，只是所有的試劑均應(yīng)用DEPC處理。
4、操作步驟：
(1)RNA經(jīng)變性電泳完畢后,可立即將乙醛酰RNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上。轉(zhuǎn)移方法與轉(zhuǎn)移DNA的方法相似。
(2)轉(zhuǎn)移完畢后 ,以6×SSC溶液于室溫浸泡此膜5分鐘,以除去瓊脂糖碎片。
(3)將該雜交膜夾于兩張濾紙中間,用真空烤箱于80℃干燥0.5-2小時(shí)。
(4) 用下列兩種溶液之一進(jìn)行預(yù)雜交，時(shí)間為1-2小時(shí)。若于42℃進(jìn)行,應(yīng)采用: 50%甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt's試劑，0.1% SDS；若于68℃進(jìn)行,應(yīng)采用:6×SSC，2×Denhardt's試劑，0.1% SDS，（注意：BLOTTO不能用于Northern雜交）。
(5) 在預(yù)雜交液中加入變性的放射性標(biāo)記探針,如欲檢測低豐度mRNA,所用探針的量至少為0.1μg,其放射性比活度應(yīng)大于2×108 cpm/分·μg,放在適宜的溫度條件下雜交16-24小時(shí)。
(6) 用1×SSC、0.1% SDS于室溫洗膜20分鐘,隨后用0.2×SSC、0.1% SDS于68℃洗膜3次,每次20分鐘。
(7) 用X光片(Kodak XAR-2或與之相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品)進(jìn)行放射自顯影,附加增感屏于-70℃曝光24-48小時(shí)。
[注意]
(1)如果瓊脂糖濃度高于1%，或凝膠厚度大于0.5cm，或待分析的RNA大于2.5kb,需用0.05mol/LNaOH浸泡凝膠20分鐘,部分水解RNA并提高轉(zhuǎn)移效率。浸泡后用經(jīng)DEPC處理的水淋洗凝膠,并用20×SSC浸泡凝膠45分鐘。然后再轉(zhuǎn)移到濾膜上。
(2)在步驟(3)的操作中，如果濾膜上含有乙醛酰RNA,雜交前需用20mmol/L Tris·Cl (pH8.0)于65℃洗膜,以除去RNA上的乙二醛分子。
(3)RNA自凝膠轉(zhuǎn)移至尼龍膜所用方法，與RNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜所用方法類似。
(4)含甲醛的凝膠在RNA轉(zhuǎn)移前需用經(jīng)DEPC處理的水淋洗數(shù)次,以除去甲醛。當(dāng)使用尼龍膜雜交時(shí)注意，有些帶正電荷的尼龍膜在堿性溶液中具有固著核酸的能力，需用7.5mmol/LNaOH溶液洗脫瓊脂糖中的乙醛酰RNA，同時(shí)可部分水解RNA，并提高較長RNA分子(>2.3kb)轉(zhuǎn)移的速度和效率。此外，堿可以除去mRNA分子的乙二醛加合物,免去固定后洗脫的步驟。乙醛酰RNA在堿性條件下轉(zhuǎn)移至帶正電荷尼龍膜的操作也按DNA轉(zhuǎn)移的方法進(jìn)行，但轉(zhuǎn)移緩沖液為7.5mmol/LNaOH，轉(zhuǎn)移結(jié)束后(4.5-6.0小時(shí))，尼龍膜需用2×SSC、0.1%SDS淋洗片刻、于室溫晾干。
(5)尼龍膜的不足之處是背景較高,用RNA探針時(shí)尤為嚴(yán)重。將濾膜長時(shí)間置于高濃度的堿性溶液中,會(huì)導(dǎo)致雜交背景明顯升高,可通過提高預(yù)雜交和雜交步驟中有關(guān)阻斷試劑的量來予以解決。
(6)如用中性緩沖液進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)移結(jié)束后,將晾干的尼龍膜夾在兩張濾紙中間,80℃干烤0.5-2小時(shí),或者254nm波長的紫外線照射尼龍膜帶RNA的一面。后一種方法較為繁瑣,但卻優(yōu)先使用,因?yàn)槟承┡?hào)的帶正電荷的尼龍膜經(jīng)此處理后,雜交信號(hào)可以增強(qiáng)。然而為獲得最佳效果,務(wù)必確保尼龍膜不被過度照射，適度照射可促進(jìn)RNA上小部分堿基與尼龍膜表面帶正電荷的胺基形成交聯(lián)結(jié)構(gòu),而過度照射卻使RNA上一部分胸腺嘧啶共價(jià)結(jié)合于尼龍膜表面,導(dǎo)致雜交信號(hào)減弱。 對(duì)分散在若干個(gè)瓊脂平板上的少數(shù)菌落（100-200）進(jìn)行克隆篩選時(shí)，可采用本方法。將這些菌落歸并到一個(gè)瓊脂主平板以及已置于第二個(gè)瓊脂平板表面的一張硝酸纖維素濾膜上。經(jīng)培養(yǎng)一段時(shí)間后，對(duì)菌落進(jìn)行原位裂解。主平板應(yīng)貯存于4℃直至得到篩選結(jié)果。
1、材料：待檢測的細(xì)菌平皿，已標(biāo)記好的探針，硝酸纖維素濾膜等。
2、設(shè)備：恒溫烤箱，恒溫水浴，臺(tái)式高速離心機(jī)等。
3、試劑：
(1)LB固體培養(yǎng)基。
(2)0.5mol/L NaOH。
(3)1mol/L Tris·Cl。
(4)1.5mol/L NaCl。
(5)0.5mol/L Tris·Cl。
(6)預(yù)洗液：5×SSC, 0.5%SDS, 1mmol/L EDTA (pH8.0)。
(7)預(yù)雜交液：50%甲酰胺，6×SSC（或6×SSPE），0.05×BLOTTO(甲酰胺可不用)。
(8)其余試劑：與Southern雜交相同。
4、操作步驟：
1. 將少數(shù)菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上：
(1) 在含有選擇性抗生素的瓊脂平板上放一張硝酸纖維素濾膜。
(2) 用無菌牙簽將各個(gè)菌落先轉(zhuǎn)移至濾膜上,再轉(zhuǎn)移至含有選擇性抗生素但未放濾膜的瓊脂主平板上。應(yīng)按一定的格子進(jìn)行劃線接種(或打點(diǎn))。每菌落應(yīng)分別劃線于兩個(gè)平板的相同位置上。最后，在濾膜和主平板上同時(shí)劃一個(gè)含有非重組質(zhì)粒（如pBR322)的菌落。
(3) 倒置平板,于37℃培養(yǎng)至劃線的細(xì)菌菌落生長到0.5-1.0mm的寬度。
(4) 用已裝防水黑色繪圖墨水的注射器針頭穿透濾膜直至瓊脂,在3個(gè)以上的不對(duì)稱位置作標(biāo)記。在主平板大致相同的位置上也作上標(biāo)記。
(5) 用Parafilm膜封好主平板,倒置貯放于4℃,直至獲得雜交反應(yīng)的結(jié)果。
(6) 裂解細(xì)菌,按本段下面所述方法,使釋放的DNA結(jié)合于硝酸纖維素濾膜。
2. 菌落的裂解及DNA結(jié)合于硝酸纖維素濾膜
(1) 在一張保鮮膜上制作一個(gè)裝有0.5mol/L NaOH的小洼(0.75ml),使菌落面朝上,將濾膜放到小洼上,展平保鮮膜,使濾膜均勻濕潤,讓濾膜留于原處2-3分鐘。
(2) 用干紙巾從濾膜的下方吸干濾膜,用一張新的保鮮膜和新配制的0.5mol/L NaOH重復(fù)步驟(1)。
(3) 吸干濾膜,將濾膜轉(zhuǎn)移到新的帶有1mol/L Tris·Cl(pH7.4)的保鮮膜洼上。5分鐘后吸干濾膜, 再重復(fù)一次該步驟。
(4) 吸干濾膜,把它轉(zhuǎn)移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris·Cl (pH7.4)的保鮮膜小洼上5分鐘后吸干濾膜,轉(zhuǎn)移到一張干的濾紙上,置于室溫20-30分鐘,使濾膜干燥。
(5) 將濾膜夾在兩張干的濾紙之間,在真空烤箱中于80℃干烤2小時(shí),固定DNA。
(6) 將固定在膜上的DNA與32 P標(biāo)記的探針雜交。
5.雜交
(1) 盛有2×SSC的塑料盤同，將干烤的濾膜飄浮在液面上,徹底浸濕5分鐘。
(2) 將濾膜轉(zhuǎn)到200ml預(yù)洗液的玻璃皿中。濾膜何疊在一起,放于溶液中。用保鮮膜蓋住玻璃皿,放到位于培養(yǎng)箱內(nèi)的旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上。于50℃處理30分鐘。在這一步及以后的所有步驟中,應(yīng)緩緩搖動(dòng)濾膜,防止它們粘在一起。
(3) 用泡過預(yù)洗液的吸水棉紙輕輕地從膜表面拭去細(xì)菌碎片,以降低雜交背景而不影響陽性雜交信號(hào)的強(qiáng)度和清晰度。
(4) 將濾膜轉(zhuǎn)到盛有150ml預(yù)雜交液的玻璃中,在適宜溫度(即在水溶液中雜交時(shí)用68℃，而在50%甲酰胺中雜交時(shí)用42℃)下,預(yù)雜交1-2小時(shí)。
(5) 將32 P標(biāo)記的雙鏈DNA探針于100℃加熱5分鐘,迅速置于冰浴中。單鏈探針不必變性。將探針加到雜交袋中雜交過夜。雜交期間，盛濾膜的容器應(yīng)蓋嚴(yán)，以防液體蒸發(fā)。
(6) 雜交結(jié)束后,去除雜交液,立即于室溫把濾膜放入大體積(300-500ml)的2×SSC和0.1% SDS溶液中,輕輕振搖5分鐘，并將濾膜至少翻轉(zhuǎn)一次。重復(fù)洗 一次，同時(shí)應(yīng)避免膜干涸。
(7)68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜兩次,每次1-1.5小時(shí)。此時(shí)已可進(jìn)行放射自顯影。如背景很高或?qū)嶒?yàn)要求嚴(yán)格的洗膜條件,可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃將濾膜浸泡60分鐘。
(8) 把濾膜放在紙巾上于室溫晾干后,把濾膜(編號(hào)面朝上)放在一張保鮮膜上,并在保鮮膜上作幾個(gè)不對(duì)稱的標(biāo)記,以使濾膜與放射性自顯影片位置對(duì)應(yīng)。
(9) 用第二張保鮮膜蓋住濾膜。加X光片并加上增感屏于-70℃曝光12-16小時(shí)。
(10) 底片顯影后,在底片上貼一張透明硬紙片。在紙上標(biāo)記陽性雜交信號(hào)的位置,同時(shí)在不對(duì)稱分布點(diǎn)的位置上作出標(biāo)記?？蓮牡灼先∠峦该骷?通過對(duì)比紙上的點(diǎn)與瓊脂上的點(diǎn)來鑒定陽性菌落。 斑點(diǎn)雜交是指將DNA或RNA樣品直接點(diǎn)在硝酸纖維素濾膜上,然后與核酸探針分子雜交，以顯示樣品中是否存在特異的DNA或RNA。同一種樣品經(jīng)不同倍數(shù)的稀釋,還可以得到半定量的結(jié)果。所以它是一種簡便、快速、經(jīng)濟(jì)的分析DNA或RNA的方法,在基因分析和基因診斷中經(jīng)常用到,是研究基因表達(dá)的有力工具。但由于目的序列未與非目的序列分離,不能了解目的序列的長度。尤其當(dāng)本底干擾較高時(shí),難以區(qū)分目的序列信號(hào)和干擾信號(hào)。
1、材料：待分析的DNA或RNA樣品，已標(biāo)記的探針。
2、設(shè)備：狹槽點(diǎn)樣器，真空泵，恒溫水浴，真空烤箱等。
3、試劑：
（1）100% 甲酰胺。
（2）甲醛(37%)。
（3） 20×SSC。
（4）0.1mol/L NaOH。
（5）硝酸纖維素濾膜。
（6）濾紙。
4、操作步驟：
(1) 10μl樣品與20μl 100%甲酰胺、 7μl 37%甲醛、2μl 20×SSC混合?；旌现糜?8℃，15分鐘后置冰浴中。
(2) 用0.1mol/L NaOH清洗點(diǎn)樣器,再用無菌水充分沖洗。將一張經(jīng)20×SSC浸潤的濾紙鋪在點(diǎn)樣器上,上面再鋪上一張經(jīng)20×SSC浸潤1小時(shí)的硝酸纖維素濾膜，加蓋并夾緊，接通真空泵。
(3) 用10×SSC清洗各樣孔。在每一樣品中加兩倍體積的2×SSC,混合后加樣于孔中。外圍幾個(gè)孔中加2μl染料定位,緩慢抽吸。每孔用1ml 10×SSC清洗兩次。繼續(xù)抽吸5分鐘,吸干濾膜。
(4) 取出濾膜,夾在兩張濾紙中間, 80℃真空烘干2小時(shí)。按上述Southern或Norhtern雜交所述的方法與放射性標(biāo)記探針雜交。
[注意]
1、在放射自顯影時(shí)應(yīng)注意濾膜必須干燥，并覆蓋上保鮮膜，否則，濾膜將與X-光片粘在一起，使以后的操作困難。
2、在雜交過程中，整個(gè)濾膜應(yīng)一直是濕潤的，不得干涸。
第三節(jié) 雜交反應(yīng)的條件及參數(shù)的優(yōu)化
不同的反應(yīng)條件對(duì)雜交結(jié)果的影響如下：
(1) 根據(jù)雜交液的體積確定雜交的時(shí)間：一般來說使用較小體積的雜交液比較好，因?yàn)樵谛◇w積溶液中，核酸重新配對(duì)的速度快、探針用量少，從而使濾膜上的DNA在反應(yīng)中起主要作用。但在雜交中必須保證有足夠的雜交溶液覆蓋雜交膜。
(2) 根據(jù)所用的雜交溶液確定雜交的溫度：一般來說，雜交相為水溶液時(shí),則在68℃雜交,而在50%甲酰胺溶液中時(shí),則在42℃下雜交。
(3) 選用不同的封閉試劑：如Denhardt's試劑、肝素或一種由5%脫脂奶粉組成的BLOTTO, 這些試劑中需加入斷裂的鮭魚精子DNA或酵母DNA，并和SDS一起使用。與Denhardt's試劑相比, BLOTTO價(jià)格便宜,使用方便,同樣可獲得滿意的結(jié)果，但它不能用于RNA雜交。一般而言,尼龍膜用Denhardt's試劑比用BLOTTO能得到更高的信噪比。對(duì)硝酸纖維素濾膜而言,通常在預(yù)雜交溶液和雜交溶液中都含有封閉劑。但是對(duì)尼龍膜，經(jīng)常從雜交溶液中省去封閉劑，因?yàn)楦邼舛鹊牡鞍踪|(zhì)會(huì)干擾探針和目的基因的退火。
(4)根據(jù)需要在雜交過程中選用不同的振蕩方法和程度,許多雜交膜一起反應(yīng)時(shí),連續(xù)的輕微振蕩可獲得較好的雜交結(jié)果。
(5) 在雜交過程中加入其他化合物, 如反應(yīng)體系中加入10%硫酸葡聚糖或10% PEG, 雜交速度可增加約10倍。檢測稀有序列時(shí)常用該方法，但它們有時(shí)會(huì)導(dǎo)致本底較高，并由于溶液的粘稠性而使操作困難。因此，除非在濾膜上含有的目的DNA量很少,或放射性探針的量有限, 一般不用硫酸葡聚糖或PEG。
(6) 根據(jù)探針與被檢測目標(biāo)之間的同源程度選擇清洗的程度,如具有很高的同源性可選用嚴(yán)緊型洗脫方式（高濃度SSC）, 反之則選用非嚴(yán)緊型洗脫方式（低濃度SSC）。洗脫通常在低于雜交體解鏈溫度12-20℃的條件下進(jìn)行。解鏈溫度(melting temperature, Tm )是指在雙鏈DNA或RNA分子變性形成分開的單鏈時(shí)光吸收度增加的中點(diǎn)處溫度。通常富含G·C堿基對(duì)的序列比富含A·T堿基對(duì)序列的Tm 溫度高。有關(guān)Tm的計(jì)算方法，請(qǐng)參考第八章。
(7) 根據(jù)標(biāo)記探針的濃度及其比活性,選擇不同的雜交條件及檢測方法。一般使用新的同位素可獲得較強(qiáng)的信號(hào)。
(8) 在水溶液中雜交時(shí),用6×SSC或6×SSPE溶液的效果都一樣。但在甲酰胺溶液中雜交時(shí),應(yīng)該用具有更強(qiáng)緩沖能力的6×SSPE。
上述這些條件的改變，對(duì)雜交的結(jié)果有不同的影響，應(yīng)根據(jù)研究的具體情況，選用適當(dāng)?shù)姆椒ā?/p>
