如何尋找轉(zhuǎn)錄起始位點
一、引物延伸分析（primer extension analysis）
引物延伸分析用于定量mRNA的量，測定低豐度的mRNA的種類。另外引物延伸實驗可標(biāo)定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5`-端， 確定轉(zhuǎn)錄的精確起始。特異的末端標(biāo)記的引物退火到RNA鏈的互補區(qū)域，隨后用RNA作為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶延伸引物得到cDNA，用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析cDNA。
cDNA的長度為引物的標(biāo)記的核苷酸到RNA-5`末端間的堿基數(shù)，所得cDNA的量和目的RNA的起始量成正比。理想的引物是ssDNA，長度為20-40個核苷酸，與要分析的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5`末端區(qū)域互補。延伸產(chǎn)物小于150個核苷酸，可得到最佳分離效果。引物延伸實驗非常靈敏，可檢測2 pg的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，這相當(dāng)于1個細胞中的1個RNA。引物延伸實驗非常適合于對單個基因作定量和定性分析。
1. ?引物延伸分析所用試劑：引物延伸實驗需要模板RNA，可用總RNA或poly(A)+RNA。一個特異的末端標(biāo)記的核苷酸或DNA片段作為引物，用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。除RNA模板和標(biāo)記的引物，還需要反轉(zhuǎn)錄酶，AMV或MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、反應(yīng)溶液、脫氧核苷酸、聚丙烯酰胺凝膠試劑，和電泳裝置。所得結(jié)果用放射自顯影和磷成像儀分析。
2. ?引物延伸系統(tǒng)的組分：引物延伸系統(tǒng)中AMV反轉(zhuǎn)錄酶和反應(yīng)溶液、焦磷酸鈉、正對照RNA模版和對照引物、去磷酸的PhiX174Hinf I DNA 標(biāo)準分子參照物、T4多核苷酸激酶和溶液、樣品溶液、AMV反轉(zhuǎn)錄酶2X溶液100 mM Tris-HCl（pH8.3， 42℃）、100 mM KCl、 20 mM MgCl2、20 mM DTT、2 mM每一種dNTP、1 mM精胺。PhiX174標(biāo)準分子參照物和T4 多核苷酸激酶用作引物標(biāo)記，和確定延伸產(chǎn)物長度的標(biāo)準。
對照RNA可得到87個堿基的延伸產(chǎn)物作為正對照。引物延伸反應(yīng)中用焦磷酸鈉和精胺可增加全長cDNA的得率，抑制模板RNA產(chǎn)生發(fā)卡結(jié)構(gòu)。雖然其作用方式未確定，但結(jié)果是增加全長cDNA的得率，抑制模板RNA產(chǎn)生發(fā)卡結(jié)構(gòu)。MMLV被焦磷酸鈉和精胺抑制，如使用MMLV，放線菌素D可用于增加全長cDNA的得率，抑制模板RNA產(chǎn)生發(fā)卡結(jié)構(gòu)。焦磷酸鈉和放線菌素D抑制cDNA第二條鏈的合成。
3. ?引物延伸實驗的優(yōu)化：
（1）雜交溫度。引物延伸實驗中所用的雜交溫度是最關(guān)鍵的需優(yōu)化的因素。一般而言，最高緊密度，或引物和互補序列完全雜交所需的最適條件是，低于引物溶解溫度的5℃。低于最高緊密度的溫度可極大地增加雜交速度。
應(yīng)在不同的緊密度的雜交溫度下作雜交，以控制引物和特異RNA的雜交。增加雜交緊密度時，帶來的延伸產(chǎn)物的丟失表明，引物和相關(guān)的卻不是等同的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交。在堿和雙價陰離子的存在下，RNA在較高溫度會降解，應(yīng)用甲酰胺雜交操作方案，這可有效降低溶解溫度，因此可使雜交在較低的溫度進行?？稍陔s交步驟中用以下的溶液：40 mM PIPES、1 mM EDTA、0.4 mM NaCl、80%的甲酰胺。如用這個雜交溶液，延伸步驟前甲酰胺和鹽需用乙醇沉淀后除去。
（2）模板RNA和引物的量。以下討論了所用RNA模板和引物的起始量。反轉(zhuǎn)錄酶對不同模板使用的效率不同。這部分是由于RNA中存在的次級結(jié)構(gòu)干擾反轉(zhuǎn)錄酶的聚合酶活力。如產(chǎn)生短的產(chǎn)物，這通常不是一個問題。如用AMV反轉(zhuǎn)錄酶，延伸溫度可達55℃。
（3）每次反應(yīng)所用RNA的量。每次反應(yīng)所用RNA和引物的量取決于分析的RNA的種類（總RNA或poly(A) + RNA），目的RNA的相對豐度。如用總RNA，起始量為10 ug，但分析稀有信號，每次反應(yīng)用100 ug RNA。poly(A)+RNA每次反應(yīng)用0.1-1.0 ug，具體決定于總RNA中poly(A)+RNA的富含量，需分析的特異RNA的濃度。在引物延伸分析前需檢查目的RNA的完整。通過凝膠分析總RNA，應(yīng)有完整的18S和28S核糖體RNA帶。在引物延伸反應(yīng)中用Northern印跡和RT-PCR分析來確定特定RNA的存在。
（4）每次反應(yīng)所用引物的量。用引物延伸實驗定量RNA，標(biāo)記的引物必須多于目的RNA。引物應(yīng)是互補RNA的5-10倍。但一般，總RNA或poly(A)+RNA中，特定目的RNA量未知。對未分析的轉(zhuǎn)錄物，初次分析用50 ug 總RNA和100 fmol 引物。如所有RNA中與引物互補的位點飽和，測試信號和投入的RNA的量成正比，而不依賴于引物的濃度。引物應(yīng)至少為20個核苷酸，雜交位點應(yīng)位于轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5`-末端下游的100個堿基處，而不會自互補。也可用從限制性酶切片段所得的ssDNA作為探針，長度應(yīng)不長于50-100個核苷酸，以獲得最佳分辨率。
（5）AMV和MMLV的選擇。引物延伸反應(yīng)通常用AMV，AMV性能更好，對次級結(jié)構(gòu)耐受。用AMV的延伸溫度可達55℃， 以消除次級結(jié)構(gòu)，但在這樣溫度下，引物延伸反應(yīng)的得率通常降低。MMLV的最適溫度為37 ℃，在更高溫度下，MMLV不穩(wěn)定，但MMLV可合成更長的產(chǎn)物，這一特點對引物延伸反應(yīng)不適用，因引物延伸反應(yīng)所得的產(chǎn)物一般較短，為100-500個核苷酸。
（6）會導(dǎo)致非特異，短的和多個引物延伸產(chǎn)物的影響因子：所研究的轉(zhuǎn)錄的差異程度可導(dǎo)致產(chǎn)生不同長度的延伸產(chǎn)物，它們來源于選擇式剪切和使用不同的轉(zhuǎn)錄起始位點。差異核RNA的存在也能導(dǎo)致產(chǎn)生多個延伸產(chǎn)物。引物和RNA中相關(guān)或無關(guān)序列的交叉雜交也會導(dǎo)致非特異延伸產(chǎn)物的產(chǎn)生。產(chǎn)物短于預(yù)測可能和RNA模板的降解有關(guān)，或者是轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中次級結(jié)構(gòu)阻制了反轉(zhuǎn)錄酶的合成，產(chǎn)生斷缺的cDNA。RNA樣品中存在DNA污染同樣可得延伸產(chǎn)物，加放線菌素D（75 ug/ml）可抑制這類產(chǎn)物的產(chǎn)生。應(yīng)作無RNA模板的負對照實驗，以確定所用試劑中無RNA和DNA污染。同時還應(yīng)用從不表達目的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的細胞或組織中提取的RNA模板作負對照實驗。
4. ? 計算RNA轉(zhuǎn)化為cDNA的量。RNA轉(zhuǎn)化為cDNA的量可對引物延伸產(chǎn)物，和`無RNA`對照實驗的cpm作測量得到。從凝膠中分別切割引物延伸產(chǎn)物和`無RNA`對照實驗中產(chǎn)物，在閃爍液中測定凝膠塊的讀數(shù)，可有效平衡聚丙烯酰胺凝膠的湮滅和32P的衰退。以下的例子表明如何計算fmol的RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，在這個例子中，一半的引物延伸產(chǎn)物（20 ul/40 ul）加入凝膠中作分析。`無RNA`對照實驗的引物濃度為100 fmol，一半的反應(yīng)液加入凝膠中作分析。切割的帶的讀數(shù)為：樣品為3912 cpm，引物為142359 cpm，首先計算引物cpm/ fmol：cpm/ fmol=142359 cpm/[100 fmolX（20/40）]=2847 cpm/ fmol，接下來計算引物延伸產(chǎn)物的fmol，或cDNA：3912 cpm/[2847 fmolX（20/40）]=2.75 fmol cDNA。所得值表明引物延伸中所得的cDNA的量。
5. ?確定引物延伸產(chǎn)物的精確長度的分子標(biāo)準參照物。為確定引物延伸產(chǎn)物的精確長度，應(yīng)同同位素標(biāo)記的DNA分子標(biāo)準參照物對照。DNA分子標(biāo)準參照物末端作了標(biāo)記，上變性凝膠前先作變性，引物延伸產(chǎn)物也作變性。長度在20-500核苷酸范圍的分子標(biāo)準參照物在確定引物延伸產(chǎn)物的長度方面很有用。去磷酸的PhiX174Hinf I DNA 標(biāo)準分子參照物非常方便，已去磷酸，可作5`末端標(biāo)記，分子標(biāo)準參照物的長度為24-726核苷酸。用于引物延伸產(chǎn)物分離的聚丙烯凝膠的規(guī)格為16X18cm， 含8%聚丙烯、7 M 尿素、1×TBE溶液。這種膠和測序膠很相似，故一般可用測序膠。應(yīng)注意不使引物延伸產(chǎn)物和自由引物跑到膠外，特別是需對cDNA定量時。
二、核酸酶S1作圖（Mapping RNA with Nuclease S1）
三種不同的核酸酶——S1核酸酶、RNA酶、外切核酸酶VII被用來進行RNA定量，確定內(nèi)含子位置，及鑒定在克隆的DNA模板上mRNA的5`-末端和3`-末端的位置。含有目的mRNA的RNA樣品與互補的DNA或RNA探針在利于形成雜合體的條件下溫育。
在反應(yīng)的末期，用核酸酶用來降解未雜合的單鏈RNA和DNA。余下的DNA-RNA或RNA-RNA雜合體用凝膠電泳分離，接著用自顯影或Southern雜交來觀察。當(dāng)探針的摩爾數(shù)在雜交反應(yīng)中過量時，信號強度與樣品中目的mRNA的濃度成正比。用過量探針與一系列定量的靶序列雜交作出標(biāo)準曲線，從而可準確估算樣品的濃度。在真核系統(tǒng)中，S1核酸酶消化過的5`-末端通常代表轉(zhuǎn)錄起始點，而3`-末端代表聚腺苷酸化的位點。同樣的策略可用來對拼接位點的5`-末端和3`-末端作圖
