根據(jù)引物合成單如何設(shè)定PCR退火溫度？
PCR退火溫度應(yīng)如何設(shè)置？
問(wèn)題：引物單上數(shù)據(jù)如下
上游TTACAAGATGGAGCCTCACC(GC含量50%)
Tm(1M Na+)：68.2
Tm(50mM Na+)：46.6
下游CAAAGAATAACCCAGGACGA(GC含量45%)
Tm(1M Na+)：66.2
Tm(50mM Na+)：44.6
順便問(wèn)下大家，Tm(1M Na+)和Tm(50mM Na+)有什么區(qū)別啊?
回答：
TM值是在一定buffer鹽濃度情況下計(jì)算出來(lái)的。你需要查一下你的PCR體系里buffer鹽的濃度，然后找相應(yīng)的TM值。不過(guò)TM值也是一個(gè)估算值，舉個(gè)例子，以你的正向引物而說(shuō)，TTACAAGATGGAGCCTCACC。在primer5計(jì)算得到TM是54.0， DNASTAR是49.1.所以這個(gè)數(shù)值僅供參考，最穩(wěn)妥的做法是用梯度PCR儀 ?從55-65做一個(gè)梯度PCR。
PCR能不能做出來(lái)最關(guān)鍵的因素有兩個(gè)，第一，模板質(zhì)量如何，第二，引物3'是否有錯(cuò)配，gc含量如何。如果錯(cuò)配不嚴(yán)重的話，采用無(wú)腦梯度pcr的方法總能找到一個(gè)合適的退火溫度 ?。
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