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時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)

2019.12.11

第一部份：時(shí)間分辨的原理、我國(guó)乙肝兩對(duì)半的流行情況及時(shí)間分辨在乙肝兩對(duì)半上的應(yīng)用技術(shù)

一、時(shí)間分辨熒光分析（ Time-resolved Fluorescence Immunoassay TRFIA ）的基本原理。

　　TRFIA 是用三價(jià)稀土離子及其螯合劑作為示蹤物，如銪（ Eu3+ ）、鋱（ Te3+ ）及釤（ Sm3+ ）、鏑（ De3+ ）等代替?zhèn)鹘y(tǒng)的熒光物質(zhì)、放射性同位素、酶和化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，來標(biāo)記抗體、抗原、多肽、激素、核酸探針或生物活性細(xì)胞，待反應(yīng)體系（如抗原抗體免疫反應(yīng)、生物素（鏈）親和素反應(yīng)、核酸探針雜交反應(yīng)、靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞的殺傷反應(yīng)等）發(fā)生后，用時(shí)間分辨熒光儀測(cè)定最后產(chǎn)物中的熒光強(qiáng)度，根據(jù)熒光強(qiáng)度和相對(duì)熒光強(qiáng)度比值，判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度，達(dá)到定量分析的目的。

運(yùn)用稀土離子及其螯合劑作為標(biāo)記物，被激發(fā)的熒光有以下特點(diǎn)：

1、與普通的熒光比較，稀土離子螯合物熒光的衰變時(shí)間長(zhǎng)，為傳統(tǒng)熒光的 103 ～ 106 倍。從而可以通過延緩測(cè)量時(shí)間，讓短壽命熒光衰變掉后，再測(cè)量目標(biāo)樣品，這樣可以最大限度地克服來自樣品、試劑的自然本底短壽命熒光（通常為 120nS ）及散射光的干擾，大大提高檢測(cè)的靈敏度。

2、激發(fā)光與發(fā)射光的 Stokes 位移大，可以達(dá)到 200 多 nm ，而普通熒光物質(zhì)的 Stokes 位移最多也只有幾十納米。這表明，在某一波長(zhǎng)測(cè)定樣品熒光時(shí)，可以通過非常簡(jiǎn)單的方法（如使用濾波片或分光計(jì)），就可消除激發(fā)光和散射光的干擾；同時(shí)，被激發(fā)的熒光光帶極窄，熒光的發(fā)射峰非常尖銳，可使儀器調(diào)整在極窄的波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定，極大地降低了來自背景的各種干擾。

3、標(biāo)記物為原子標(biāo)記，體積很小，標(biāo)記后不會(huì)影響被標(biāo)記物的空間立體結(jié)構(gòu)，這既保證了被檢物質(zhì)的穩(wěn)定性（尤其對(duì)蛋白質(zhì)影響更小），又可實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)標(biāo)記。標(biāo)記物穩(wěn)定，就可以對(duì)標(biāo)記物進(jìn)行多次激發(fā)，通過對(duì)每次激發(fā)的熒光信號(hào)累加后（如激發(fā)測(cè)量 1000 次）取平均值的辦法，可以大大減少偶然誤差的產(chǎn)生，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度；同時(shí)多位點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)，不僅使檢測(cè)更靈敏，也可使用雙標(biāo)記技術(shù)使一個(gè)試劑盒能夠同時(shí)檢測(cè)出兩種或兩種以上的項(xiàng)目。

　　TRFIA 技術(shù)集酶標(biāo)記、同位素標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)于一身，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、標(biāo)記物制備簡(jiǎn)便、儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)、無放射性污染、檢測(cè)重復(fù)性好、操作流程短、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬和應(yīng)用范圍廣泛等優(yōu)點(diǎn)，成為繼放射免疫分析之后，標(biāo)記免疫分析法發(fā)展的一個(gè)新的里程碑，被稱之為 " 零本底 " 的檢測(cè)方法。其靈敏度大大地超過了放射性同位素（如表 1 所示），是目前配基結(jié)合分析中最有發(fā)展前途的一項(xiàng) 生化超微量檢測(cè)手段，非常適用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)上的超微量分析。

表 1 　常見標(biāo)記免疫學(xué)比較

二、乙肝在我國(guó)的流行情況：

　　慢性乙型病毒性肝炎（ Chronic Viral Hepatitis B,CH-B ）是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病，我國(guó)是病毒性肝炎的高發(fā)區(qū)，乙型肝炎病毒（ HBV ）感染率高達(dá) 57.63% ，即全國(guó)至少有　 6 億人感染過 HBV ?，F(xiàn)在乙肝病人達(dá) 2700 萬，且每年新發(fā)病例近 1000 萬， HbsAg 陽性率 9.75% ，約有 1.2 億人，占全球的 1/3 ，其中約 1/4 將發(fā)展為慢性肝病，部分患者可發(fā)展為肝硬化，甚至演變?yōu)楦伟?。?jù)統(tǒng)計(jì)每年有 23.7 萬人死于乙型肝炎相關(guān)的疾病，其中有 15.6 萬人死于肝癌。大概有 5%-10% 的成年人和 70%-90% 的嬰兒受感染后未能完全清除病毒而成為長(zhǎng)期帶病毒者，同時(shí)亦成為傳播根源。
乙型肝炎血清學(xué)標(biāo)志物為檢測(cè)乙肝病毒感染的最主要病原標(biāo)志和直接證據(jù)之一。在病毒感染緩解和愈合的不同時(shí)期，可有不同的存在模式。常見模式乙肝五項(xiàng)指標(biāo)的臨床意義如下：

表 2 　常見模式乙肝五項(xiàng)的臨床意義

　　除上述常見模式外，還存在一些非常規(guī)模式，包括 HBsAg 與 HBsAb 同時(shí)存在的模式。 ( 只在現(xiàn)在 HbsAg 1 μ g / L 以下的人群中 ) 推測(cè)二者同存的原因可能是 HBV 發(fā)生變異引起 [2] ；近年來亦有發(fā)現(xiàn) HBeAg 可以與 HBeAb 共存的模式，在慢性乙型肝炎伴活動(dòng)期肝損傷時(shí)，幾乎 100% 為 HbeAg 、 HBeAb 共存。因之，對(duì)乙肝血清標(biāo)志物的測(cè)定對(duì)臨床有著極其重要的價(jià)值。
近年來醫(yī)學(xué)臨床和預(yù)防的要求對(duì)低水平存在的血清學(xué)標(biāo)志物進(jìn)行有效檢測(cè)，具有更重要的臨床和流行病學(xué)意義。研究證實(shí)，在部分 HBV 感染的人群中，血清表面抗原呈低水平存在，容易造成漏檢。尤其是目前普遍采用的酶標(biāo)檢測(cè)方法，對(duì)低水平人群更容易造成漏檢。在較大范圍的非肝炎患者住院人群的檢測(cè)結(jié)果表明，血清 HBsAg 約在 5 μ g/L 以下者占總?cè)巳旱?2.34% ；占 HBsAg 陽性人群的 23.16% ，其中， HBsAg 濃度在 1 μ g/L 以下的占多數(shù)（ 44.40% ） [2] 。多方面研究表明，低水平血清 HBsAg 人群占有不小的比例，尤其我國(guó)是乙肝的高發(fā)區(qū)，加之人口眾多，此類人群不容忽視。由于檢查方法上的不靈敏，還可導(dǎo)致乙肝病毒通過手術(shù)，輸血等途徑發(fā)生傳播等嚴(yán)重后果。因此，進(jìn)一步提高血清 HBsAg 檢測(cè)的靈敏度有重要意義。

三、時(shí)間分辨技術(shù)定量檢測(cè)乙肝兩對(duì)半的重大意義

　　運(yùn)用 TRFIA 對(duì)乙肝五項(xiàng)進(jìn)行定量檢測(cè)極大地彌補(bǔ)了酶標(biāo)法定性檢測(cè)的不足，成為乙型肝炎血清學(xué)標(biāo)志物現(xiàn)代臨床檢驗(yàn)的發(fā)展方向，新波公司為此研制了 HBV 的 TRFIA 試劑盒，并獲得國(guó)家批準(zhǔn)文號(hào)，這是一個(gè)可喜的成果，它將推動(dòng)我國(guó)乙肝防治工作和進(jìn)展，同時(shí)亦將推動(dòng) TRFIA 技術(shù)的普遍應(yīng)用。 TRFIA 在 HBV 感染診斷及免疫力監(jiān)測(cè)方面的定量檢測(cè)具有如下優(yōu)越性：

◇ 極大地提高了檢測(cè)的靈敏度

　　時(shí)間分辨熒光免疫定量技術(shù)（ TRFIA ）檢測(cè) HbsAg 靈敏度可達(dá) 0.2ng/ml, 而酶標(biāo)（ EIASA ）檢測(cè)的靈敏度是 2ng/ml ，極大地提高檢測(cè)的靈敏度。因此，在急性乙肝早期能及早檢出 HbsAg ，確證 HBV 感染，縮短窗口期；其次，可發(fā)現(xiàn)低濃度 HbsAg 攜帶者；在部分慢性乙肝患者中，由于機(jī)體缺乏對(duì) HBV 包膜蛋白的免疫應(yīng)答， HbsAg 表達(dá)較低，酶標(biāo)檢測(cè)可出現(xiàn) HbsAg 和 HbsAb 均陰性的情況， TRF 技術(shù)則可避免這些情況的發(fā)生，為正確判斷病情提供依據(jù)。

◇ 能動(dòng)態(tài)觀察療效和監(jiān)測(cè)病情
1 ）定量分析 HBsAg 和 HBsAb 的濃度變化，可預(yù)見急性乙肝是否處于恢復(fù)期。如 HBsAg 濃度降低， HBsAb 濃度逐漸升高，可說明病情正往恢復(fù)期發(fā)展；反之， HBsAg 濃度處于較高水平或上升趨勢(shì)，而 HBsAb 一直處于較低水平，則易發(fā)展為慢性乙肝或病毒攜帶者。

2 ）定量分析 HBeAg 和 HBeAb 的濃度變化，可反映病情變化和治療效果。定量測(cè)定能明確檢測(cè) HBeAg 向 HBeAb 轉(zhuǎn)換的時(shí)期，即表現(xiàn)為 HBeAg 濃度下降和 HbeAb 升高的過程。高濃度的 HBeAg 還可間接提示病毒處于高復(fù)制狀態(tài)，具有較高的傳染性。高濃度的 HBeAb 一方面提示病情好轉(zhuǎn)，而在某些時(shí)候（如肝功能指標(biāo)很差）則可能與肝壞死、肝硬化、肝癌有關(guān)。

3 ）HBcAb 濃度的高低可反映病毒感染的狀態(tài)。高濃度的抗 - Hbc 提示乙肝急性感染，恢復(fù)期濃度降低。慢性乙肝呈抗 - Hbc 持續(xù)高濃度。而低濃度的抗 - Hbc 一般為恢復(fù)期或既往感染。

4 ）有利于對(duì)慢性肝炎活動(dòng)性或非活動(dòng)性的判斷。非活動(dòng)性慢性乙肝各項(xiàng)指標(biāo)相對(duì)穩(wěn)定，活動(dòng)性往往呈現(xiàn)進(jìn)行性變化。

◇ TRFIA 和定量 PCR 技術(shù)可互相補(bǔ)充

　　血清 HBV-DNA 熒光定量 PCR 測(cè)定可以直接反映血液中病毒復(fù)制狀態(tài)，具有很多臨床應(yīng)用價(jià)值，但不能完全反映病毒復(fù)制靜息期肝細(xì)胞內(nèi) HBV 病毒狀態(tài)。 HBV-DNA 陰性并不完全代表體內(nèi) HBV 已被清除，結(jié)合 " 兩對(duì)半 " 各項(xiàng)指標(biāo)更能客觀反映體內(nèi) HBV 病毒狀態(tài)。

◇ HbsAb 的定量測(cè)定能夠?qū)σ腋蔚念A(yù)防起到監(jiān)督作用
　　 HbsAb 的定量測(cè)定能夠?qū)贵w是否真正具有 " 中和 "HBV 的免疫力作出正確評(píng)價(jià)，對(duì)乙肝的預(yù)防起到監(jiān)督作用。 HbsAb 的含量在 10mlU/ml 以上病人 ELISA 檢測(cè)即可呈陽性結(jié)果，但并不提示機(jī)體都一定具有免疫力，而 HBsAb 的含量在 10-100mlU/ml 之間的樣本，定性雖為 " 陽性 " ，但此時(shí)機(jī)體對(duì) HBV 的免疫力較弱，甚至不能預(yù)防 HBV 感染。只有 HbsAb 的含量達(dá)到 100mlU/ml 以上時(shí)才可確定具有抵抗 HBV 入侵的作用。作定量檢測(cè)，可根據(jù) HBsAb 的含量判斷機(jī)體對(duì) HBV 的免疫狀態(tài)及乙肝疫苗的免疫效果。因此定量測(cè)定對(duì)乙肝疫苗免疫力的評(píng)價(jià)和高危人群預(yù)防免疫具有重要意義，特別是在少年兒童預(yù)防乙肝方面。

時(shí)間分辨除了在乙肝兩對(duì)半項(xiàng)目上的應(yīng)用外，在以下項(xiàng)目上也有廣泛的應(yīng)用：

一、內(nèi)分泌科檢查：
甲狀腺系列： Ultra TSH, T3, T4, FT4, TBG, TG
糖尿病系列： Insulin ,C- Peptie
生長(zhǎng)激素類： hGH
其它： Cortisol

二、婦產(chǎn)科檢查
FSH, LH, HCG, Prolactin E2, E3, Testo , Prog , SHBG

三、腫瘤科檢查
AFP, CEA, PSA, HTG, β-2 Micro, NSE, PAP, PSA(Free/Total), PSA EQA, CA-50*, CA-125* ,CA-199* ,CA-153* ,CA-724* ,CY-211*

四、遺傳科檢查
產(chǎn)前篩查： h AFP ,/ β HCG , PAPPA
新生兒篩查： Neo- TSH, Neo -T4, Neo- IRT, Neo -17 a - OH, Prog , PKU, G6PD

第二部份：時(shí)間分辨技術(shù)應(yīng)用在乙肝兩對(duì)半上的典型效益分析

方案一：以供貨商提供儀器的合作方式（針對(duì)月最低用量在 800 人份以上，合作年限不低于 3 年的用戶）：
以每天 50 個(gè)標(biāo)本，每年 360 天計(jì)算：
醫(yī)院收入（年）：
125 元 / 人份（深圳市衛(wèi)生局 " 深衛(wèi)函【 2004 】 272 號(hào) " 已批的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)） x 50 人份 / 天 x 360 天 = 225 萬元
試劑成本（年）：
45 元 / 人份（每人份試劑成本） x 50 人份 / 天 x 360 天 = 81 萬元
成本 / 毛收入 =36%
一年的毛利潤(rùn)： 144 萬元

方案二：院方自購儀器的用戶：
以月用量為每月 8 套乙肝兩對(duì)半（ 800 人份 / 月）的量估算：
醫(yī)院收入（年）：
12 （個(gè) 月） x 800 人份 / 月 x125 元 / 人份（深圳市衛(wèi)生局 " 深衛(wèi)函【 2004 】 272 號(hào) "
已批的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)） = 120 萬元
試劑成本（年）：
12 （個(gè) 月） x 800 人份 / 月 x45 元 / 人份 = 43.2 萬元
成本 / 毛收入 =36%
一年的毛利潤(rùn)： 76.8 萬元

3、儀器投資：一套時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)系統(tǒng)的報(bào)價(jià)是： 42 萬元人民幣。

醫(yī)院可以在一年內(nèi)輕松收回儀器投資并創(chuàng)造一定的利潤(rùn)。

熒光

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