單分子熒光成像概述：TIRF和FRET

2021.10.16

經(jīng)典的生物研究技術(shù)側(cè)重于分子和細(xì)胞集群的研究——即研究含有大量相同形態(tài)或功能的分子或細(xì)胞的活動(dòng)。但是，這種方法會(huì)忽略集群中的單個(gè)分子或子群的特異性。事實(shí)上在細(xì)胞周期的不同階段或在不同的環(huán)境中，單個(gè)分子或細(xì)胞的活動(dòng)很可能與集群表現(xiàn)出的整體活動(dòng)不同。要對單個(gè)分子或亞群的活動(dòng)進(jìn)行觀察，必須嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，保證每個(gè)分子的狀態(tài)相同。

單分子熒光成像技術(shù)可以分為兩類：一類是在外力作用下研究單分子活動(dòng)，通常通過原子力顯微鏡（AFM）、光鑷（OT）或磁鑷（MT）將力施加到單個(gè)分子上。另一類就是用熒光顯微成像觀察生物系統(tǒng)中單分子活動(dòng)。

熒光顯微成像是生命科學(xué)領(lǐng)域觀察生物體結(jié)構(gòu)的經(jīng)典方法。這其中，用熒光探針標(biāo)記，檢測和分析單個(gè)分子的單分子熒光成像技術(shù)，能夠幫助科學(xué)家們在不破壞生命體正常生理狀態(tài)的情況下，清晰地觀察到單個(gè)分子的活動(dòng)。

單分子熒光成像技術(shù)

我們常用的寬場顯微鏡能夠同時(shí)觀察數(shù)百個(gè)分子和它們之間的相互作用，使研究人員能夠輕松地收集到大量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，同時(shí)還增加了檢測到小概率事件的可能性。但是由于它不能排除來自焦平面上下的雜散信號(hào)，信噪比較差（圖1），對于本身信號(hào)已經(jīng)很弱的單分子熒光來說，寬場成像不是一種好的成像方法。

圖1 普通熒光和TIRF照明下表達(dá)GFP的Hela細(xì)胞在同一焦平面的圖像。Scale bar: 10 μm

共聚焦顯微鏡可以克服寬場顯微鏡的問題，拒絕雜散光，這樣就可以只對感興趣的平面成像。由于共聚焦顯微技術(shù)的特點(diǎn)，科學(xué)家們將它應(yīng)用于DNA修復(fù)等領(lǐng)域，直接觀察核苷酸切除修復(fù)蛋白與DNA的結(jié)合（Segers-Nolten et al. 2002）。

TIRF

全內(nèi)反射熒光顯微鏡（TIRF）是單分子熒光成像最常用的方法之一，被用于研究肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)（Zimmerman et al.）以及分子擴(kuò)散（Fujiwara et al.，2016）等。簡單來說，TIRF是利用光線全反射后在介質(zhì)另一面產(chǎn)生衰逝波的特性，使用特定角度的激發(fā)光，令所有的光都被反射。這樣在全反射區(qū)域的另一面就會(huì)產(chǎn)生衰逝波，對樣本表面的極薄區(qū)域（通常在200nm以下）進(jìn)行照明（圖2）。由于衰逝波是呈指數(shù)衰減的，只有極靠近全反射面的樣本區(qū)域會(huì)被激發(fā)，從而大大降低了背景噪聲，提高了信噪比（圖1）。TIRF廣泛應(yīng)用于對細(xì)胞表面物質(zhì)的動(dòng)態(tài)觀察，如固定在蓋玻片或細(xì)胞膜表面上的分子等。

圖2 傳導(dǎo)波和衰逝波的差別。傳導(dǎo)波（propagating wave）以線性方式在組織中傳播，可激發(fā)深度大于1 mm的熒光基團(tuán)。由TIRF產(chǎn)生的衰逝波（Evanescent wave），激發(fā)深度僅為約100nm

FRET

如果一個(gè)熒光分子（供體分子）的發(fā)射光譜與另一個(gè)熒光分子（受體分子）的吸收光譜有一定的重疊，當(dāng)這兩個(gè)分子的距離足夠近（通常為1-10nm）的時(shí)候，供體的熒光能量可以向受體轉(zhuǎn)移，表現(xiàn)為受體的熒光增強(qiáng)，同時(shí)供體自身的熒光衰減。這就是熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）。FRET 程度與供、受體分子的空間距離緊密相關(guān)，隨著距離延長， FRET顯著減弱。而FRET速率與兩個(gè)分子間的距離成正比。利用這種供體和受體分子之間非輻射能量轉(zhuǎn)移的原理，F(xiàn)RET可以作為“光譜標(biāo)尺”，用來確定兩個(gè)熒光分子的接近程度。

Theodor F?rster在1960年最早提出了FRET，并通過Stryer & Haugland（1967）等人的實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)。通過單分子FRET技術(shù)，我們能在單個(gè)分子內(nèi)或分子復(fù)合物中，以納米尺度實(shí)時(shí)追蹤變化，了解目標(biāo)分子在細(xì)胞內(nèi)的空間分布，從而幫助解答許多重要的生物學(xué)問題。目前單分子FRET已經(jīng)成為研究蛋白質(zhì)&核酸結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)的理想技術(shù)。包括觀察酶在其功能周期中的構(gòu)象變化 (Dyla et al. 2016)，實(shí)時(shí)監(jiān)測DNA合成 (Fijen et al. 2017)等。

圖3 發(fā)生FRET必須滿足的三個(gè)最重要的條件：（a）供體的發(fā)射光譜必須與受體的激發(fā)光譜重疊。（b）供體和受體距離<10nm（c）供體和受體熒光雙極相互平行。（Broussard et al.2013年）

PALM/STORM

除了TIRF和FRET，我們在超分辨專題中給大家介紹的光激活定位顯微技術(shù)（PALM）和隨機(jī)光學(xué)重建顯微技術(shù)（STORM）也是單分子熒光成像技術(shù)。這里就不多做贅述，大家可以閱讀我們之前的技術(shù)文章前沿顯微成像技術(shù)專題——超分辨顯微成像（1）復(fù)習(xí)一下~

如何選擇適合單分子熒光成像的相機(jī)

由于單個(gè)熒光基團(tuán)的信號(hào)強(qiáng)度本身已經(jīng)很弱，對信噪比的挑戰(zhàn)很大。有時(shí)單分子成像還需要很快的速度，曝光時(shí)間較短，進(jìn)一步降低信號(hào)強(qiáng)度。因此，決定單分子熒光成像質(zhì)量的一個(gè)最重要的因素就是能否從背景噪聲中檢測出微弱的信號(hào)——這就需要高靈敏度、低噪聲和高速的檢測設(shè)備了。

EMCCD 曾經(jīng)是單分子熒光成像的首選，這是因?yàn)樗?5%的量子效率和電子倍增過程帶來的高信噪比。然而，由于存在增益衰減，EMCCD 的成像效果不穩(wěn)定，信噪比也會(huì)收到電子倍增過程帶來的額外噪聲的影響而降低。

隨著科學(xué)相機(jī)技術(shù)的飛速發(fā)展，背照式 sCMOS 相機(jī)誕生了。它和 EMCCD 一樣具有95%量子效率和極低的讀出噪聲，但是不存在EMCCD增益衰減和額外噪聲的問題，因此能夠保證以極高的信噪比檢測單分子熒光信號(hào)。同時(shí)，背照式 sCMOS在速度、視野和性價(jià)比上都具有很大的優(yōu)勢，因此，近年來越來越多的單分子熒光成像應(yīng)用已經(jīng)“移情別戀”，使用背照式 sCMOS 取代傳統(tǒng)的 EMCCD，取得了非常好的成像效果。

熒光染料

單分子熒光技術(shù)的基礎(chǔ)是用熒光染料對感興趣的分子進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記方法和熒光染料的選擇至關(guān)重要，需要根據(jù)樣品和特定成像技術(shù)的需要進(jìn)行選擇。標(biāo)記單個(gè)分子的方法有很多，包括抗體標(biāo)記、生物素化、表位標(biāo)記、小分子探針和生物正交標(biāo)記等。一般來說，用于單分子成像的熒光染料應(yīng)該滿足以下要求：

熒光效率高，實(shí)現(xiàn)信號(hào)最大化
熒光穩(wěn)定（不快速光漂白），允許較長時(shí)間成像
熒光分子小，不破壞目標(biāo)分子的生物活性
發(fā)射光譜在可見光區(qū)域，最好是在相機(jī)量子效率峰值的區(qū)域。

常見的熒光染料包括有機(jī)染料（如FITC、TRITC）、熒光蛋白（如GFP、YFP）和量子點(diǎn)。當(dāng)然，這些染料并不是完美的，也有著各自的優(yōu)缺點(diǎn)，我們將在后面的文章中給大家做詳細(xì)的介紹。

與集群研究相比，單分子熒光成像能夠揭示單個(gè)分子的結(jié)構(gòu)和功能。自從20世紀(jì)90年代單分子成像技術(shù)被廣泛應(yīng)用以來，已經(jīng)開發(fā)出許多新技術(shù)，包括效率更高的熒光染料和更靈敏的科學(xué)相機(jī)，使得單分子實(shí)驗(yàn)中信噪比低的問題得到了很好的解決。這也使得單分子熒光成像越來越受到歡迎。

REFERENCES

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