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酶標(biāo)儀-測(cè)定波長(zhǎng)

2021.11.12

  一般酶標(biāo)儀的測(cè)定波長(zhǎng)在400~750nm或800nm之間,完全可以滿足ELISA的顯色測(cè)定。目前國(guó)內(nèi)常見的ELISA試劑盒所使用的標(biāo)記用酶均為辣根過氧化物酶(HRP),底物通常為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和鄰苯二胺(OPD),其在過氧化氫溶液的存在下,經(jīng)HRP作用,分別氧化為2,2,—二氨基偶氮苯(DAB)和聯(lián)苯醌。當(dāng)pH值為5.0左右時(shí),DAB在450nm波長(zhǎng)處有最大吸收,當(dāng)pH值降為L(zhǎng) 0時(shí),最大吸收波長(zhǎng)移至492 nm,同時(shí)摩爾消光系數(shù)變大,顯色加深,因而常用強(qiáng)酸如硫酸或鹽酸終止反應(yīng)。TMB的氧化產(chǎn)物聯(lián)苯醌在波長(zhǎng)450nm處有最大消光系數(shù),如果HRP量少,H:O:和TMB過量時(shí),則形成藍(lán)色的陽離子根。降低pH,即可使藍(lán)色的陽離子根轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的聯(lián)苯醌,使用硫酸作為終止劑可使產(chǎn)物穩(wěn)定90min。因此,450nm和492 nm兩個(gè)波長(zhǎng)是目前ELISA測(cè)定最常用的。各種酶標(biāo)儀都配有放置濾光片的可自動(dòng)轉(zhuǎn)換的部件,可以同時(shí)安裝6~8片濾光片,所配備的濾光片均應(yīng)包括上述兩個(gè)波長(zhǎng),有的酶標(biāo)儀以490nm濾光片替代492nm濾光片,影響不大。除了這兩個(gè)基本濾光片外,考慮到雙波長(zhǎng)比色的需要,還應(yīng)有620nm或630nm或650nm和405nm波長(zhǎng)的濾光片,其他濾光片可根據(jù)自己的需要選擇。有時(shí),有的實(shí)驗(yàn)室希望用酶標(biāo)儀作微量生化測(cè)定,故酶標(biāo)儀生產(chǎn)廠家對(duì)其生產(chǎn)的酶標(biāo)儀擴(kuò)展了紫外檢測(cè)功能,此時(shí)需要一個(gè)340 nm波長(zhǎng)濾光片。此時(shí),酶標(biāo)儀的測(cè)定波長(zhǎng)范圍就成為340—750nm或800nm。

  酶標(biāo)儀有單波長(zhǎng)和雙波長(zhǎng)檢測(cè)功能。有時(shí)使用者不知在什么情況下使用單或雙波長(zhǎng)檢測(cè)。所謂的“單波長(zhǎng)”就是使用一種對(duì)顯色具最大吸收的波長(zhǎng)即450 nm或492 nm進(jìn)行比色測(cè)定;而“雙波長(zhǎng)”則除了用對(duì)顯色具最大吸收的波長(zhǎng)即450 nm或492 nm進(jìn)行比色測(cè)定外,同時(shí)用對(duì)特異顯色不敏感的波長(zhǎng)如630 nm進(jìn)行測(cè)定,酶標(biāo)儀最后打印出來的吸光度則為二者之差。630 nm波長(zhǎng)下得到的吸光度是非特異的,來自于板孔上諸如指紋、灰塵、臟物等所致的吸收。因此,在ELISA比色測(cè)定中,最好使用雙波長(zhǎng),且不必設(shè)空白孔。


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