直接免疫熒光法測抗原
基本原理
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將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點(diǎn)是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細(xì)菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。
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試劑與儀器
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磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
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熒光標(biāo)記的抗體溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進(jìn)行稀釋
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緩沖甘油：分析純無熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制
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搪瓷桶三只（內(nèi)有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
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有蓋搪瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布?jí)|）
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熒光顯微鏡
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玻片架
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濾紙H
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37℃溫箱等。
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實(shí)驗(yàn)步驟
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1、滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待檢標(biāo)本片上，10min后棄去，使標(biāo)本保持一定濕度。
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2、滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記的抗體溶液，使其完全覆蓋標(biāo)本，置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，保溫一定時(shí)間（參考：30min）。
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3、取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗后，再按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸 3-5 min，不時(shí)振蕩。
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4、取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋。
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5、立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標(biāo)本的特異性熒光強(qiáng)度，一般可用“+”表示：
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（-）無熒光；（±）極弱的可疑熒光；（+）熒光較弱，但清楚可見；（++）熒光明亮；（+++ --++++）熒光閃亮。待檢標(biāo)本特異性熒光染色強(qiáng)度達(dá)“++”以上，而各種對(duì)照顯示為（±）或（-），即可判定為陽性。
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注意事項(xiàng)
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1、對(duì)熒光標(biāo)記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應(yīng)超過1：20，抗體濃度過低，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱，影響結(jié)果的觀察。
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2、染色的溫度和時(shí)間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化，染色時(shí)間可以從10 min到數(shù)小時(shí)，一般30
min已足夠。染色溫度多采用室溫（25℃左右），高于37℃可加強(qiáng)染色效果，但對(duì)不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫，延長染色時(shí)間。低溫染色過夜較37℃30
min效果好的多。
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3、為了保證熒光染色的正確性，首次試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對(duì)照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。
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（1） 標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照：標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。
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（2） 特異性對(duì)照（抑制試驗(yàn)）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。
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（3） 陽性對(duì)照：已知的陽性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。
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如果標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照和特異性對(duì)照呈無熒光或弱熒光，陽性對(duì)照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光，則為特異性陽性染色。
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4、一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3min，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標(biāo)本最好在當(dāng)天觀察，隨著時(shí)間的延長，熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降。
