5分鐘了解全貌：拉曼光譜緣何成為儀器界寵兒?
現(xiàn)在，大家乘坐地鐵一定有這樣的體驗，安檢員直接把我們帶的水瓶放在一臺儀器上檢測，而不再像過去要求“喝一口”來“驗明正身”，該儀器就是可以透過包裝檢測的拉曼光譜。三星和蘋果的PR們今年都不斷放出消息刺激市場，要出一種無創(chuàng)檢測血糖的智能手表，采用的也是拉曼技術，只是遲遲未見真顏看來還頗有點兒難度。各大公司都不斷收購拉曼技術，中國的拉曼企業(yè)也蓬勃增長到30余家，研究級拉曼和便攜式拉曼應如何區(qū)分？拉曼誕生于很弱的散射信號，為何現(xiàn)在又昂首進軍到單細胞檢測的前沿領域？看完本文，希望對大家有所幫助。此外，還可品鑒一下各家公司的新款產(chǎn)品，為下次入囊做點準備。
拉曼緣起
1928年，印度科學家C.V. Raman觀察到一個現(xiàn)象：當光穿過透明介質(zhì)，部分被散射的光發(fā)生頻率改變，這一現(xiàn)象被稱之為拉曼散射。C.V. Raman也因為這一發(fā)現(xiàn)獲得了1930年諾貝爾物理學獎。
圖1?拉曼光譜的發(fā)現(xiàn)者：印度科學家C.V. Raman及其發(fā)現(xiàn)的拉曼散射
我們可以做一個更詳細的解釋，當來自光源的高強度入射光被試樣分子散射后，大多數(shù)散射光與入射激光具有相同的波長(或顏色)，這種散射稱為瑞利散射。然而，還有極小一部分(大約占1/107散射光的波長(或顏色)發(fā)生了改變，其波長的變化由試樣分子的化學結構所決定，這部分散射光稱為拉曼散射。
圖2?拉曼散射（右下，紅色）和瑞利散射（右上，綠色）
拉曼譜圖通常由一定數(shù)量的拉曼峰構成，每個拉曼峰代表了相應的拉曼散射光的波長位置和強度。每個譜峰對應于一種特定的分子鍵振動，其中既包括單一的化學鍵，例如C-C, C=C, N-O, C-H等，也包括由數(shù)個化學鍵組成的基團的振動，例如苯環(huán)的呼吸振動，多聚物長鏈的振動以及晶格振動等。換句話說，拉曼光譜對于分子鍵合以及樣品分子的結構非常敏感，每種分子或樣品都有其特定的拉曼光譜“指紋”。這些“指紋”可以用來進行化學鑒別、形態(tài)與相、內(nèi)壓力/應力以及組成成分方面的研究。
從弱到強逆襲的拉曼
激光光源：拉曼的發(fā)現(xiàn)雖然獲得Nobel獎，但當時信號太弱無法應用，直到上世紀60年代激光光源發(fā)展起來?，F(xiàn)代的拉曼均采用激光光源，許多情況下可以滿足測試需求。
增強技術：隨后就是大名鼎鼎的表面增強拉曼散射（SERS）技術，這讓拉曼逆襲成為高靈敏度儀器。1974年，英國皇家學會院士M. Fleischmann團隊研究發(fā)現(xiàn)了吡啶吸附的粗糙銀電極的表面增強拉曼光譜（SERS）信號。表面增強拉曼散射( SERS) 效應是指在特殊制備的一些金屬良導體表面或溶膠中，在激發(fā)區(qū)域內(nèi)，由于樣品表面或近表面的電磁場的增強導致吸附分子的拉曼散射信號比普通拉曼散射(NRS) 信號大大增強的現(xiàn)象。表面增強拉曼散射（SERS）技術克服了傳統(tǒng)拉曼光譜與生俱來的信號微弱的缺點，可以使得拉曼強度增大幾個數(shù)量級，其增強因子可以高達1014－1015倍，足以探測到單個分子的拉曼信號。但金、銀貴金屬限制了其的廣泛應用。作為SERS創(chuàng)始人M. Fleischmann的弟子和繼承者，廈門大學田中群院士發(fā)現(xiàn)VIII B族過渡金屬元素具有弱的SERS效應，系統(tǒng)發(fā)展了非傳統(tǒng)SERS 和電化學拉曼光譜實驗和理論方法，顯著拓展SERS 方法普適性，推進其應用和產(chǎn)業(yè)化。目前，出現(xiàn)SERS現(xiàn)象的金屬材料分別是幣族金屬金，銀，銅；堿性金屬鋰，鈉，鉀；部分過渡金屬鐵，鈷，鎳。
圖3?表面增強拉曼散射SERS
發(fā)展SERS各種基底材料與SERS機理的研究均在進行，目前認為SERS有電磁場增強，化學相互作用，化學增強等多種機理。SERS目前的難點是：（1）大都采用貴金屬，造價高難普及；（2）還不夠穩(wěn)定重現(xiàn)；（3）難以做多目標檢測。（4）金、銀、銅金屬尚需表面粗糙化處理之后才具有高SERS 活性，故表面科學界所常用的平滑單晶表面皆無法用SERS 研究。
針尖增強拉曼散射光譜（TERS）可以解決SERS的應用受到材料，形態(tài)和分子通用性的限制。TERS采用尖銳的尖端，由Au或Ag組成或涂有Au或Ag。在一些情況下，Au或Ag納米顆?；蚣{米結構可以附著到AFM或SFM探針，尖端在合適的激發(fā)源激發(fā)下產(chǎn)生局部增強的電磁場。增強的電磁場可以將吸附的探針分子和表面的拉曼信號增強多達六個數(shù)量級。AFM和拉曼的聯(lián)用，同時也把空間分辨率大幅提高到亞納米級別。
物美價廉：另一項逆襲的重要原因就是物美價廉的便攜/手持拉曼的出現(xiàn)，且聽后文分解。
拉曼和紅外那點事兒
說到光譜“指紋”，大家一定想到紅外光譜，紅外和拉曼有啥不同？
首先原理上，紅外測定的是分子對入射紅外光的吸收，橫坐標用波數(shù)或波長表示。拉曼測定的是入射光照到樣品上樣品再散射出來的光和原始入射光的差值（拉曼位移），橫坐標是拉曼位移，由于和樣品作用后大部分會損失能量，因此其中大部分是Stokes散射（比入射光頻率降低），極小部分是反Stokes散射。
圖4?光散射的機理
其次在應用上，紅外光譜只能用紅外光，由于水對紅外的吸收太強，所以自古紅外“怕水”，因此制樣麻煩。拉曼光譜測的是位移，入射光選擇范圍就寬了，可以很好地避開水的干擾，可見區(qū)常選藍光/紅光/綠光，還可選擇近紅外光（比如呼之欲出的智能手表），甚至紫外光（大連化物所的李燦院士發(fā)明的就是紫外拉曼）。拉曼有個缺點，就是易受熒光干擾，做樣前可先試試各可見光，如果還不行再試785nm或1064nm的近紅外光源，不過從光強度考慮，當然能用可見光更好。
由于透射性好，拉曼可以透過包封，測定任何對激光透明的介質(zhì)，如玻璃，塑料內(nèi)，或溶于水的樣品。藥廠、化工廠用拉曼來做原料或庫管樣品的檢驗，那可是便攜拉曼的看家本領。這類應用的共性就是檢測的成分簡單，含量較高，不用HPLC分離，不用制樣，透過包裝就快速檢測。對于特別復雜的成分，還是勸君上色譜；對于特別痕量的成分，研究者在模型體系中探索SERS的可能性，距離實用性的SOP和標準嘛，還需同仁們努力。
從譜圖上來看，紅外和拉曼反映的都是分子的振動，紅外光譜主要反映分子的官能團，而拉曼光譜主要反映分子的骨架，兩者在譜圖上有互補對應的關系。相較而言，紅外區(qū)的橫坐標是400~4000cm-1；拉曼在3000cm-1以上峰很少，但在400cm-1以下有信號，所以橫坐標常為200-2000cm-1或200-3000cm-1（還可以向更低波數(shù)擴展）。
“互補“是什么意思呢？極性高的不對稱分子，紅外譜峰強；極化率高的對稱分子，拉曼譜峰強。一般說來，無機化合物的拉曼光譜信息量比紅外光譜的大。
拉曼光譜的分類及優(yōu)缺點小結
拉曼光譜可分為四大類：便攜/手持拉曼；傅里葉拉曼；拉曼成像；在線拉曼。其中，傅里葉拉曼雖然分辨率、測定適用性各項性能都挺好，好幾家都造出了傅里葉紅外拉曼一體機，但無奈其甘于中游，既沒有解決便攜和便宜的問題，也沒有解決最高端前沿的問題，因此市場越來越小。
圖5?傅里葉拉曼光路圖
便攜/手持拉曼是近年來發(fā)展最快的拉曼品種。不怕水、透過包裝、貼近樣品快速測試的特性最早用于制藥業(yè)。由于結構比較簡單，當時美國的企業(yè)尋找了中國的OEM/ODM企業(yè)，在市場快速增長的同時，中國也逐步掌握了便攜拉曼的核心技術。隨著價格的下降，國家安全領域大批采購便攜拉曼光譜儀，同時中國在SERS技術上的進步，又帶動了食品安全領域的廣泛采購。由于集成度非常高，很多科研單位的老師可以毫不費力地購買集成模塊的微型光譜儀，再買來激光源、拉曼探頭、采樣支架就可迅速組裝出一臺拉曼光譜儀，來針對各類樣品開發(fā)拉曼原位快速測量的應用。
圖6 便攜拉曼光路圖
拉曼成像包括三種，分別是：（1）單點成像的顯微微區(qū)拉曼；（2）對某區(qū)域進行面成像的拉曼；（3）共聚焦拉曼，可在XYZ方向觀測不同深度而成像。大多數(shù)拉曼成像的商品化儀器都是同光學顯微鏡聯(lián)用的，一個樣本可得到多種成像譜。
拉曼光譜的優(yōu)點
總體來看，拉曼光譜儀具有如下優(yōu)點：
首先從光譜的通性來看，樣品制備簡單或無需制備；不受樣品物質(zhì)形態(tài)的影響；對樣品無損傷；快速分析；維護成本低，使用簡單。
其次，拉曼獨有的特點是：分辨率高，特異性好（這點同紅外類似）；適合水樣品；能夠透過玻璃、塑封袋直接檢測；使用SRERS后還可大幅提升靈敏度；和AFM聯(lián)用后使用TERS技術不僅提高靈敏度還提高空間分辨率到亞納米。便攜拉曼的普及使價格大幅下降。
拉曼光譜需要改進之處
目前的拉曼還有一些缺點，這也是研究者需要努力的地方。
首先，普通拉曼信號弱，對深色樣品信號更弱（光大部分被吸收了）。
其次，由于均采用激光，對爆炸物分析不很友好，需降低激光能量，減少采集時間，當然會損害靈敏度。
第三，各廠家的譜圖不統(tǒng)一各家均用自建譜庫，SERS技術重現(xiàn)性目前還不高，給標準化帶來挑戰(zhàn)。
第四，熒光背景干擾是個難點。消除熒光干擾的方法包括：做樣前采用強光照射法破壞熒光分子。加入熒光淬滅劑使得熒光熄滅。利用拉曼和熒光產(chǎn)生的時間不同，使用高頻調(diào)制的激光信號來分離拉曼和熒光信號。此外還有：
紫外/近紅外激發(fā)法。大部分物質(zhì)熒光主要在可見區(qū)（300 nm~700 nm），使用紫外拉曼（如244 nm激發(fā)）或近紅外拉曼（785、830、1064 nm激發(fā)）可有效避開熒光干擾，缺點是紫外光可能導致樣品分解，近紅外光熱效應較強且檢測器成本高。
移頻激發(fā)法：使用兩個頻率相近的激光先后照射樣品，拉曼譜峰頻率與激發(fā)光頻率同步變化，而熒光光譜對激發(fā)光頻率改變不敏感。因此將兩組光譜信號差分處理可消除熒光干擾，然后通過算法可以從差分光譜重構出拉曼光譜。商品化領域有幾家開發(fā)了此技術。
拉曼光譜的市場分析和預測
拉曼光譜的市場預期
作為近年來分析領域一顆熠熠閃光的新星，拉曼發(fā)展速度之快讓很多技術望其項背。每年都會有多家機構相繼發(fā)布拉曼的研發(fā)報告。根據(jù)Data Bridge Market Research的報告，全球拉曼光譜市場預計在2021-2028年間的復合年增長率（CAGR）將為7.56%，預計2028年拉曼市場的銷售額將達到5.3億美元。而QYResearch研究報告顯示，2020年全球拉曼光譜儀市場規(guī)模達到了22億元，預計2026年將達到38億元，年復合增長率為8.0%。雖然不同預測報告的數(shù)據(jù)稍有差異，但都顯示了拉曼高潛力的增長態(tài)勢，表現(xiàn)出對其未來市場的良好預期。其中，北美是拉曼儀器的第一大市場，約占34%的市場份額。其次是歐洲和中國，總計約占45%的市場份額。中國拉曼技術雖然起步較晚，但近年來得到很大的發(fā)展。由于客戶所需要的各種新應用不斷被開發(fā)，5年前中國拉曼光譜市場年銷量1,000余臺，現(xiàn)在已達10,000臺的年銷量，并且還在呈現(xiàn)不斷上漲的趨勢。
圖7 全球拉曼光譜的市場預測（摘自Data Bridge Market Research）
醫(yī)療行業(yè)的藥物開發(fā)、半導體工業(yè)的發(fā)展和擴張、樣品檢測需求極大增加、市場對實時在線檢測的要求及以國土安全為目的檢測需求的增加，加上拉曼光譜在技術上的進步，都是拉曼光譜市場快速增長的重要刺激因素。值得一提的是，由于制藥和電子行業(yè)的需求和應用量的增加，預計亞太地區(qū)復合增長率將達到全球最高。
根據(jù)“中國政府采購網(wǎng)“發(fā)布的中標信息顯示，據(jù)不完全統(tǒng)計，在過去的一年里有800多個采購項目發(fā)布了關于拉曼的招標公告，涉及科研院所、高校、醫(yī)院、公安部門（包括緝毒）、海關、食品藥品監(jiān)管機構、文物考古單位、石油化工、環(huán)境、珠寶鑒定等，一些著名高校和中科院是招標的主力（主要在金額上的貢獻），激光顯微（共聚焦）拉曼、在線拉曼等是招標重點；而檢驗及現(xiàn)場執(zhí)法機構，重點招標便攜或小型化的拉曼光譜儀。
拉曼光譜儀器的市場布局
拉曼“耀眼”的前景，使得一些大牌儀器廠商無一不在拉曼上布局。Horiba堀場、Renishaw雷尼紹、Thermo賽默飛作為拉曼光譜老牌企業(yè)，占據(jù)了全球拉曼市場40%以上的份額。而且這些企業(yè)還在拉曼領域持續(xù)投入，加強構建自己的核心競爭力，并通過不斷地“攻城略地”，在某些領域處于強勢地位。
儀器行業(yè)并購案例迭出，拉曼光譜也不例外：如瑞士萬通并購了全球最大的小型拉曼光譜儀生產(chǎn)商必達泰克（BWTEK）的全部業(yè)務；安捷倫科技收購了拉曼光譜創(chuàng)新企業(yè) Cobalt Light Systems；安東帕收購BaySpec拉曼產(chǎn)品線購買SciAps公司拉曼技術；牛津儀器3.2億元收購拉曼成像技術商WITec等。德國耶拿雖然沒加入到浩蕩的并購大軍，但自2015年起，耶拿全面負責其兄弟公司凱撒公司在中國的拉曼業(yè)務，籍此，耶拿也進入中國的拉曼市場。
中國拉曼光譜的市場潛力和蓬勃生機，吸引了眾多著名企業(yè)，如安捷倫、海洋光學、安東帕、凱撒光學、布魯克、島津、耶拿等，他們相繼推出了最新的拉曼光譜產(chǎn)品，憑借核心技術優(yōu)勢和跨國合作機會，占據(jù)了很大的市場份額。
為了打破進口儀器壟斷國內(nèi)市場的局面，國內(nèi)高校和科研機構聯(lián)合生產(chǎn)企業(yè)，推動國產(chǎn)儀器發(fā)展，如清華大學、廈門大學、青島海洋所等都是產(chǎn)學研用的典范。國內(nèi)的同方威視、奧譜天成、如海光電、卓立漢光等企業(yè)，都開發(fā)出了頗具市場競爭力的特色產(chǎn)品。同方威視在中國安檢市場具有強大的競爭力，而其全資子公司北京鑒知技術有限公司（簡稱：鑒知技術），則用于拓展安檢之外的其他應用領域。中國的拉曼市場和歐美不盡相同，重要著力點在安檢領域，其次是食品安全?？傮w來說，目前國內(nèi)廠家自主研發(fā)的小型拉曼光譜儀的硬件水平已媲美甚至超過進口品牌，但是在軟件、算法、譜圖庫的建設等方面，依然與國外存在一定的差距。
建立行業(yè)規(guī)范，推動拉曼光譜儀發(fā)展
法規(guī)與制度的缺失，必然會導致不合格儀器進入市場，甚至出現(xiàn)“劣幣驅(qū)逐良幣”的情況；此外，同質(zhì)化競爭也不利于市場的穩(wěn)定與發(fā)展。建立拉曼儀器的規(guī)范標準，是推動拉曼光譜儀市場健康發(fā)展的必然要求。值得慶幸的是，近十年來，拉曼光譜相關的標準的制修訂在有條不紊地進行。據(jù)不完全統(tǒng)計，目前發(fā)布（包括即將實施的）拉曼光譜相關的國家推薦標準有10項，行業(yè)標準有8項（包括JY/T, SF/T, SN/T等）。另外，一系列的團體標準也已發(fā)布實施。
2020年版《中國藥典》明確了拉曼光譜法的技術優(yōu)勢及應用，如“快速，準確，測量時通常不破壞樣品（固體，半固 體，液體或氣體），樣品制備簡單甚至不需樣品制備。并且能夠現(xiàn)場或在線用于過程分析，使用簡單，分析速度快（幾秒到幾分鐘），性能可靠?！保弧袄庾V既適合于化學鑒別和固體檢測，也能夠用于假藥檢測和質(zhì)量控制。”； 分別從“原料入場”到“制藥過程”再到“成品藥質(zhì)量控制”的一系列過程中實現(xiàn)游刃有余的快速無損檢測。
值得重點關注的是，我國首次制定并由國家市場監(jiān)督管理局和國家準備委員會共同頒布，福建省計量院、廈門大學等聯(lián)合同方威視、卓立漢光、奧譜天成、天美儀拓、如海光電、鑒知技術等十幾家企業(yè)共同起草的《GB/T 40219-2021 拉曼光譜儀通用規(guī)范 》（2021年12月1日實施），對于我國拉曼市場的良性健康發(fā)展具有重要意義。GB/T 40219-2021對拉曼光譜儀器進行了嚴格規(guī)范，它將有助于拉曼光譜的生產(chǎn)、使用和市場推廣，推動行業(yè)的良性競爭。
但是，對于拉曼光譜儀目前及未來拓展的應用領域和應用方向，目前的標準還不夠豐富全面，期待更多應用標準出臺，為拉曼光譜技術的發(fā)展和應用“保駕護航”。
拉曼的前世今生就介紹到這里，若您關心當前市場上正熱門的商品化產(chǎn)品，請聽下文分解。
