核酸檢測革命：可替代PCR的犀利技術(shù)——RPA

2019.3.02

導(dǎo)讀

重組酶聚合酶擴增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術(shù)。本專題為大家詳細(xì)介紹RPA的原理、引物設(shè)計、疑難解答以及在致病菌檢測、病毒檢測以及癌癥研究中的靈活應(yīng)用。

自PCR技術(shù)誕生以來已經(jīng)有三十年了，從經(jīng)典PCR、實時定量PCR再到現(xiàn)在的數(shù)字PCR，這一技術(shù)在不斷蛻變卻從未淡出我們的視野。很多人的實驗根本離不開PCR。筆者曾經(jīng)也接觸PCR很長一段時間，加樣、設(shè)置程序、等待、檢測。這些過程看起來容易，但實驗結(jié)果卻總是會出人意料，很多時候根本不知道是哪里出了錯。那么要是有一款技術(shù)，它比PCR更快速、便捷、高效，你會感興趣嗎？

RPA是什么？

biodiscover1419554975.7369449.jpg

基本原理

重組酶聚合酶擴增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術(shù)。RPA技術(shù)主要依賴于三種酶：能結(jié)合單鏈核酸（寡核苷酸引物）的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，zui適反應(yīng)溫度在37°C左右。

重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動DNA合成，對模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴增。被替換的DNA鏈與SSB結(jié)合，防止進(jìn)一步替換。在這個體系中，由兩個相對的引物起始一個合成事件。整個過程進(jìn)行得非常快，一般可在十分鐘之內(nèi)獲得可檢出水平的擴增產(chǎn)物。

biodiscover1419555064.749394.jpg

圖片來源：Isothermal amplified detection of DNA and RNA

引物設(shè)計

RPA分析的關(guān)鍵在于擴增引物和探針的設(shè)計。PCR引物多半是不適用的，因為RPA引物比一般PCR引物長，通常需要達(dá)到30-38個堿基。引物過短會降低重組率，影響擴增速度和檢測靈敏度。在設(shè)計RPA引物時，變性溫度不再是影響擴增引物的關(guān)鍵因素。RPA的引物和探針設(shè)計不像傳統(tǒng)PCR那樣成熟，用戶需要自己摸條件進(jìn)行優(yōu)化。

優(yōu)勢

常規(guī)PCR必須經(jīng)過變性、退火、延伸三個步驟，而PCR儀本質(zhì)上就是一個控制溫度升降的設(shè)備。RPA反應(yīng)的zui適溫度在37℃-42℃之間，無需變性，在常溫下即可進(jìn)行。這無疑能大大加快PCR的速度。此外，由于不需要溫控設(shè)備，RPA可以真正實現(xiàn)便攜式的快速核酸檢測。

據(jù)介紹，RPA檢測的靈敏度很高，能夠?qū)⒑哿康暮怂幔ㄓ绕涫荄NA）模板擴增到可以檢出的水平，從單個模板分子得到大約1012擴增產(chǎn)物。而且RPA還用不著復(fù)雜的樣品處理，適用于無法提取核酸的實地檢測。

RPA既可以擴增DNA也可以擴增RNA，還省去了額外的cDNA合成步驟。你不僅可以對擴增產(chǎn)物進(jìn)行終點檢測，還可以對擴增過程進(jìn)行實時監(jiān)控，甚至可以通過試紙條（側(cè)流層析試紙條LFD）讀取結(jié)果。

RPA可以用來干什么？

biodiscover1419555267.8856203.jpg

RPA對硬件設(shè)備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。以下為大家介紹RPA在細(xì)菌、病毒檢測以及癌癥研究等領(lǐng)域的應(yīng)用情況。

RPA成為致病菌檢測的得力工具

在今年發(fā)表的一系列文章中，RPA技術(shù)被廣泛用于艱難梭狀芽孢桿菌、結(jié)核桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA、淋病奈瑟氏菌（Neisseria gonorrhoeae）、沙門氏菌、大腸埃希菌STEC等常見致病菌的檢測。在臨床診斷和食品安全方面，為人們提供了簡單快速的實地篩查方案。（這篇文獻(xiàn)之前報道過，在這里就不詳述了。）[詳細(xì)]

RPA技術(shù)建立沙眼衣原體快速檢測方法

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis）感染是zui常見的性傳播疾病之一。沙眼衣原體影響5-10%的人口，常見于小于25歲的成年人。目前廣泛使用的沙眼衣原體檢測方法是以聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)為基礎(chǔ)，這種方法只適合于經(jīng)過專業(yè)訓(xùn)練的人員在具有特定儀器的實驗室使用。

日前，發(fā)表在《分子診斷雜志》（The Journal of Molecular Diagnostics）雜志上的一項研究中，研究人員利用RPA技術(shù)開發(fā)了一種檢測沙眼衣原體的快速、靈敏的新方法，利用該方法在20分鐘內(nèi)即可得出檢測結(jié)果。[參考文獻(xiàn)]

研究人員利用RPA技術(shù)直接從患者尿液樣本中檢測沙眼衣原體，不需要從尿液樣品提取總DNA，也不需要專門的儀器設(shè)備。而且該檢測方法還具有少費力、少耗時、更經(jīng)濟等特點。與目前的沙眼衣原體檢測方法比較而言，該方法還能夠顯著提高檢測的敏感性和特異性

RPA檢測瘧原蟲

biodiscover1419555579.2535630.jpg

澳大利亞科學(xué)家首次捕捉到瘧原蟲入侵并摧毀人體紅細(xì)胞畫面

核酸擴增是目前zui靈敏的瘧原蟲（P. falciparum）特異性檢測法。然而，PCR需要熱循環(huán)設(shè)備和專業(yè)性操作，資源匱乏的地區(qū)往往難以滿足這些條件。在這種情況下，與側(cè)流層析結(jié)合的RPA有著很大的應(yīng)用前景。

《Malaria Journal》雜志今年三月份發(fā)表的一項研究中，研究人員將RPA基礎(chǔ)反應(yīng)、TwistAmp nfo探針和側(cè)流層析結(jié)合起來，實現(xiàn)了瘧原蟲18S rRNA基因的高靈敏度快速檢測。在38°C的條件下，只需要不到十分鐘的擴增，就能檢出含有四個瘧原蟲的樣本。加上側(cè)流層析的檢測時間，整個流程總共只需要15分鐘，而且肉眼可以直接看到檢測結(jié)果。

研究人員用不同瘧原蟲測試了這種方法的靈敏度和特異性。研究顯示，所有瘧原蟲都被成功檢出，所有非瘧原蟲都得出了陰性結(jié)果。文章指出，這一方案將大大改善資源匱乏地區(qū)的瘧原蟲分子診斷。[參考文獻(xiàn)]

RPA檢測冠狀病毒

2012年在中東首次鑒定的中東呼吸綜合癥冠狀病毒( Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)是一種新型的冠狀病毒。這種病毒很快傳入了歐洲，給公共安全機構(gòu)敲響了警鐘。

目前，MERS-CoV檢測主要依賴于實時RT-PCR，需要收集患者樣本然后到專門的實驗室去檢驗。因此，亟需能夠進(jìn)行實地檢測的快速裝置。

《PLOS Currents：Outbreaks》去年十二月發(fā)表的一項研究，開發(fā)了一個能在3-7分鐘內(nèi)鑒定MERS-CoV的便攜式RT-RPA裝置。在42°C條件下，等溫MERS-CoV RT-RPA與實時RT-PCR一樣敏感，可檢出10個RNA分子。文章指出，這個便攜裝置是監(jiān)控MERS-CoV傳播，尋找其動物宿主的理想方法。[參考文獻(xiàn)]

RPA檢測埃博拉等十種致命威脅

biodiscover1419556180.790204.jpg

檢測傳染性疾病的綜合panel，有助于資源匱乏地區(qū)進(jìn)行實地分子診斷，對生物防御工作也有很大的幫助。

《Journal of Clinical Microbiology》雜志去年四月的一項研究開發(fā)了一個RPA檢測panel，對土拉弗朗西斯氏菌（Francisella tularensis）、鼠疫耶爾森氏菌（Yersinia pestis）、炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis）、天花病毒進(jìn)行RPA分析，對裂谷熱病毒（Rift Valley fever virus）、埃博拉病毒、Sudan病毒和馬爾堡病毒進(jìn)行RT-RPA分析。研究顯示，這些RPA和RT-RPA的分析靈敏度大多在16-21個分子之間（與實時PCR相當(dāng)），42°C下只需運行6-10分鐘，而且不存在交叉反應(yīng)。[參考文獻(xiàn)]

RPA檢測HIV

在HIV診治中，即時檢測是非常重要的，對嬰兒來說更是如此。有案例顯示，HIV感染后立刻進(jìn)行治療就能控制住患者體內(nèi)的病毒，讓它們無法進(jìn)行復(fù)制。舉例來說，生來就攜帶HIV的密西西比嬰兒，在出生后立即得到了治療。后來這個孩子停藥了兩年多，病毒復(fù)制依然得到了控制。

目前嬰兒HIV診斷的金標(biāo)方法是DNA PCR，但許多地區(qū)并不具備這樣的條件。在這種條件下，RPA技術(shù)正好可以大展身手。（四篇論文介紹了RPA在HIV檢測中的應(yīng)用）[詳細(xì)]

RPA在癌癥研究中的應(yīng)用

去年六月，新加坡A*STAR的研究團(tuán)隊在Lab on a Chip雜志上，發(fā)表了一種能夠快速檢測癌癥單點突變的新技術(shù)，等溫固相擴增/檢測（ISAD）。這是一種無需標(biāo)記的實時檢測技術(shù)，將基于硅基微環(huán)（silicon microring）的固相擴增與等溫重組酶聚合酶擴增（RPA）結(jié)合在一起。

去年十月，Talanta雜志上也發(fā)表了一項用到RPA技術(shù)的癌癥研究。該研究在超靈敏生物條碼分析（BBC）、適配體（aptamer）和RPA的基礎(chǔ)上，開發(fā)了一個檢測細(xì)胞色素C（Cyto-c）的新生物條碼分析法（ABC）。細(xì)胞色素C是細(xì)胞死亡的重要標(biāo)志物。（點擊鏈接查看這兩項研究的詳細(xì)報道和文獻(xiàn)）[詳細(xì)]

RPA全攻略之疑難解答

biodiscover1419556126.6673853.jpg

說了這么多，你們肯定會有很多疑問，引物怎么設(shè)計？RPA反應(yīng)能實現(xiàn)多重化么?RPA反應(yīng)能對模板進(jìn)行定量么? RPA支持生物素或熒光標(biāo)記的寡核苷酸么? RPA支持生物素或熒光標(biāo)記的寡核苷酸么?以下就為大家一一解答。

RPA的擴增引物可以說是整個反應(yīng)的關(guān)鍵所在，那么怎樣才能設(shè)計好RPA引物呢？引物長度怎樣選擇？引物序列有什么要求？擴增產(chǎn)物長度有何限制？篩選的主要流程？答案詳見《RPA：引物與探針的常見問題》一文。此外，在該文中你還可以找到以下問題的答案。

biodiscover1419560092.2591323.png

biodiscover1419559784.5799789.png

可以。RPA在同一個管中同時進(jìn)行多個擴增反應(yīng)。不過，多重化的引物組合需要精心設(shè)計，以便每個引物都能同樣有效的工作。需要注意的是，RPA反應(yīng)的引物總量(nmol)zui好不要超標(biāo)太多。如果在一個反應(yīng)中使用兩個以上的擴增引物，就應(yīng)該控制不同引物的量。另外，我們應(yīng)當(dāng)事先考慮好檢測多個擴增事件的探針、設(shè)備以及熒光團(tuán)的兼容性。

biodiscover1419559806.2304818.png

可以。擴增子達(dá)到可檢出水平的時間，依賴于反應(yīng)起始時的模板量。初始模板的拷貝越多，擴增子就越快達(dá)到可檢出水平。不過，這種定量需要精心的實驗安排，確保對照反應(yīng)是同時開始的。舉例來說，可以利用鎂離子的添加時間進(jìn)行控制。因為鎂離子一旦進(jìn)入體系，RPA反應(yīng)就會開始。

此外，較慢的擴增過程有助于更精確的定量。我們可以通過調(diào)整反應(yīng)條件或引物設(shè)計來減慢RPA的反應(yīng)速度。

biodiscover1419559818.981618.png